1、分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 3 期，第 819-825 页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.3,819-825研究报告Research Report斑地锦肉桂酸 4-羟基化酶基因及启动子的克隆与分析郭三保1,2黄胜和1*邹嘉轩3刘欢胜3全文军3杨晖11 江西中医药高等专科学校医学基础部,抚州,344000;2 江西中医药高等专科学校药学系,抚州,344000;3 南昌大学抚州医学院,抚州,344000*通信作者,摘要槲皮素属于黄酮类化合物，是斑地锦主要药效成分之一，在槲皮素生物合成过程中，肉桂酸 4-羟基化酶(C4H)是一个关键酶
2、。为了阐明斑地锦中槲皮素生物合成机制，应用同源克隆结合 RACE 技术、Tail-PCR，获得 C4H 基因编码区及其启动子序列，RT-qPCR 技术检测基因在不同生长期不同组织中的表达模式，并对启动子进行生物信息学分析。结果显示，斑地锦 C4H 基因编码区为 1 518 bp，编码 505 个氨基酸，与麻疯树C4H 氨基酸序列的相似性高达 93.1%。RT-qPCR 实验表明，斑地锦中 C4H 基因在苗期根中表达水平最高。克隆到的 C4H 基因启动子长约为 1 440 bp，内含 TAAT-box、CAAT-box 等序列。此结果丰富了 C4H 基因资源，也为进一步研究斑地锦 C4H 基因功
3、能及表达调控提供基础。关键词斑地锦;C4H 基因;启动子;克隆;RT-qPCRCloning and Analysis of Cinnamate Acid 4-hydroxylase Gene and ItsPromoter from Euphorbia maculata L.Guo Sanbao1,2Huang Shenghe1*Zou Jiaxuan3Liu Huansheng3Quan Wenjun3Yang Hui11 Department of Basic Medicine,Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,
4、344000;2 Department of Pharmacy,Jiangxi College ofTraditional Chinese Medicine,Fuzhou,344000;3 Fuzhou Medical College,Nanchang University,Fuzhou,344000*Corresponding author,DOI:10.13271/j.mpb.021.000819AbstractQuercetin belongs to the flavonoids family and is one of the main medicinal ingredients of
5、 Euphorbiamaculata.The cinnamate 4-hydroxylase(C4H)is a keyenzyme in quercetin biosynthesis.To explore the mechanismof quercetin biosynthesis in Euphorbia maculate,the ORF of C4H gene and its promoter sequence were cloned byhomologous cloning,RACE technology,and Tail-PCR.Then,gene expression levels
6、were detected with RT-qPCRin different tissues during different growth periods,and the bioinformatic analysis of this gene and its promoterwas performed.The results showed that the opening reading frame(ORF)of EmC4H gene was 1 518 bp,encoding505 amino acid residues which sequence was 93.1%similar to
7、 the amino acid sequence of Jatropha curcas.AndEmC4H expression could be detected in all tissues at different expression levels during different growth periods,with the strongest expression in the roots at the seedling stage.Besides,the promoter length of C4H gene clonedwas about 1 440 bp,containing
8、 TAAT-box,CAAT-box.These results enriched the C4H gene resources and willprovide a foundation for further research on gene function and expression regulation of C4H gene in Euphorbiamaculate.KeywordsEuphorbia maculate L.;C4H gene;Promoter;Cloning;RT-qPCR基金项目：本研究由江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ203301)资助引用格式：Guo S
9、.B.,Huang S.H.,Zou J.X.,Liu H.S.,Quan W.J.,and Yang H.,2023,Cloning and analysis of cinnamate acid 4-hydro-xylase gene and its promoter from Euphorbia maculata L.,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(3):819-825.(郭三保,黄胜和,邹嘉轩,刘欢胜,全文军,杨晖,2023,斑地锦肉桂酸 4-羟基化酶基因及启动子的克隆与分析,分子植物育种,21(3):819-825.)
10、分子植物育种Molecular Plant Breeding斑地锦(Euphorbia maculate L.)是大戟科(Euphor-biaceae)大戟属(Euphorbia L.)一年生草本植物，分布于江西、浙江、河南和新疆等地区(中国科学院中国植物志编辑委员会,1997)，具有清热解毒、凉血止血、利湿退黄等功效，主治痢疾、泄泻、咯血、尿血、便血、崩漏、疮疖痈肿、湿热黄疸等(国家药典委员会,2015)。斑地锦主要含有黄酮类、萜类、酚酸类和生物碱类等成分，其中槲皮素是主要药效成分之一(安惠霞等,2008)。目前，斑地锦研究主要集中在成分分离、药用价值、质量标准控制以及临床应用等方面(Luy
11、enet al.,2014;Wang et al.,2017;胡建新等,2018;Tianet al.,2019)，分子生物学相关研究鲜有报道。槲皮素是黄酮类化合物之一，其生物合成经由苯丙烷代谢途径，而肉桂酸 4-羟基化酶(cinnamate4-hydroxylase,C4H)是苯丙烷代谢途径的关键酶之一，C4H 在转录水平上的丰度能有效影响植物中黄酮类化合物的生物合成量(Millar et al.,2007;Li et al.,2010)。C4H 基因已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Mizutani et al.,1997)、向日葵(Helianthus annuus
12、 L.)(Wang et al.,2020)、白梨(Pyrus bretschneideri)(Li etal.,2020)等植物中被克隆，但斑地锦 C4H 基因克隆还未见报道。本实验根据已知的植物 C4H 基因进行同源序列比对，在高度保守区设计简并引物，应用PCR 法结合 RACE 技术、热不对称 PCR(Tail-PCR)(Liu and Chen,2007)从斑地锦中克隆 C4H 基因及其启动子，并进行生物信息学分析，进而采用 RT-qPCR技术，以 EF-1 为内参基因，检测斑地锦 C4H 在苗期、花期和果期不同组织中的表达情况。这既可丰富C4H 基因资源，也对探讨斑地锦苯丙烷类次生代
13、谢途径具有重要意义。1结果与分析1.1斑地锦C4H基因的克隆用试剂盒提取斑地锦总 RNA，琼脂糖凝胶电泳检测质量良好。根据同源克隆法设计简并引物，PCR获得斑地锦 C4H 基因保守序列，3RACE 法得到 3 端序列，Tail-PCR 进行染色体步移获得基因 5 端序列。将保守序列、3 端序列、5 端序列用 DNASTAR 软件进行组装，再设计特异引物扩增 ORF 区(图 1)。斑地锦 C4H 基因 ORF 区包含 1 518 bp，编码 505 个氨基酸，其中氨基酸序列与麻疯树(Jatropha curcas L.)、橄榄(Canarium album)的序列相似性高达 93.1%、91.9
14、%。将此基因命名为 EmC4H，并登录到 GenBank(登录号:MT951411)。1.2斑地锦C4H的生物信息学分析用在线工具 Protparam 分析斑地锦 C4H蛋白的理化性质，等电点(pI)为 8.79，相对分子质量为 57.91kD。TMHMM 2.0 预测 EmC4H 含有 1 个跨膜区域，位于523 位氨基酸之间。Phyre 三维建模结果(图 2)。利用NCBI 在线 BLAST 工具将 C4H 与 GenBank 中其他植物 C4H 蛋白进行比对，选择相似性最高的 17 种C4H 蛋白，用 Distance tree of results 中的 NeighborJoining
15、 法构建系统进化树(图 3)。1.3 C4H基因在不同生长期组织表达模式分析分别提取斑地锦苗期和花期根、茎、叶以及果期根、茎、叶、果的总 RNA，以 EF-1 为内参基因，进行RT-qPCR 扩增。结果显示，EmC4H 在苗期的根中表达量最高，其次为花期的根、果期的茎，在各生长期的叶内表达量都较低(图 4)。1.4 C4H基因启动子序列的获得与分析以基因组DNA 为模板，Tail-PCR 法进行染色图 1 EmC4H 基因的克隆注:M:Trans2KPLUS DNA Marker;1:斑地锦总 RNA;2:保守序列 PCR 产物;3:3RACE 产物;4,5:5 端 Tail-PCR 第二,三
16、轮产物;6:ORF 区 PCR 产物Figure 1 Cloning of EmC4H geneNote:M:Trans2KPLUS DNA Marker;1:Total RNA of Eu-phorbia maculate;2:PCR product of conserved sequence;3:PCR product of 3RACE;4,5:5 Tail-PCR product of the secondand third rounds;6:PCR product of ORF820体步移，克隆 EmC4H 启动子(图 5)。测序结果获得约1 440 bp 的启动子序列，用 Plantcare 和 PLACE 分析显示内含 TAAT-box、CAAT-box 等基本启动子序列，也含有 Box 4(ATTAAT)、TCT-motif(TCTTAC)、Sp1(GGGCGG)、GT1-motif(GGTTAA)光反应元件和ABRE(ABA 反应元件)、CGTCA-motif(MeJA 反应元件)激素反应元件等。2讨论苯丙烷代谢途径是植物重要的次生代谢途径之一。该途径以苯丙氨酸为底物，