1、广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2023 Jan；40（1）Liproxstatin-1对K562白血病细胞的增殖抑制作用及其机制研究*梁诗婧1，董海群2，许玉玲2，孙娜2，赵慧涵1，程鹏2，应燕萍1（广西医科大学第一附属医院1.护理部；2.血液内科，南宁530021）摘要目的：研究Liproxstatin-1（Lip-1）对K562白血病细胞株的抑制作用。方法：采用CCK-8法检测不同浓度Lip-1处理前后的细胞活力。将未经任何处理的K562细胞作为对照组，10 mol/L Lip-1处理24 h的K562细胞作为低浓度组，20 mo
2、l/L Lip-1处理24 h的K562细胞作为高浓度组。用二代测序法分析各组转录组表达差异。分别采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、Western blotting法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂-1A（CDKN1A）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）基因及蛋白表达，流式细胞术检测细胞周期时相，微量法测定细胞内谷氨酸含量。将K562细胞在含或不含谷氨酰胺培养基中培养，用细胞计数法检测细胞倍增时间（DT）变化。结果：Lip-1浓度依赖性抑制K562白血病细胞增殖。与对照组相比，低、高浓度组CDKN1A、SLC7A11基因及蛋白表达水平增高（P0.05），高浓度组细胞内谷氨酸含量
3、下降（P0.05），低浓度组发生G1/S阻滞，而高浓度组同时存在G1/S和G2/M阻滞。K562细胞在不含谷氨酰胺培养基培养时细胞的DT较含谷氨酰胺组增高（P0.05）。结论：Lip-1可抑制K562白血病细胞增殖，其机制可能与SLC7A11表达增高引起的谷氨酸剥夺及CDKN1A表达增高引起的细胞周期阻滞有关。关键词Liproxstatin-1；白血病；谷氨酸；细胞周期阻滞中图分类号：R733.7文献标志码：A文章编号：1005-930X（2023）01-0039-07DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2023.01.007Study on the inhibitory ef
4、fect of Liproxstatin-1 on the proliferation of K562 leukemia cellsand its mechanismLiang Shijing1,Dong Haiqun2,Xu Yuling2,Sun Na2,Zhao Huihan1,Cheng Peng2,Ying Yanping1.(1.Departmentof Nursing;2.Department of Hematology,The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning530021,China)
5、AbstractObjective:To study the inhibitory effect of Liproxstatin-1(Lip-1)on K562 leukemia cell line.Meth-ods:CCK-8 method was used to detect the cell viability of different concentrations of Lip-1 before and after treat-ment.Untreated K562 leukemia cells were taken as control group,K562 leukemia cel
6、ls treated with 10 mol/LLip-1 for 24 h were taken as low concentration group,and K562 leukemia cells treated with 20 mol/L Lip-1 for24 h were taken as high concentration group.The differences of transcriptome expression were analyzed by sec-ond generation sequencing.Real-time fluorescence quantitati
7、ve polymerase chain reaction(RT-qPCR)and west-ern blotting were used to detect the gene and protein expressions of cyclin-dependent kinase inhibitor-1A(CD-KN1A)and solute carrier family 7 member 11(SLC7A11),respectively.Flow cytometry was used to detect thecell cycle phase.The content of glutamic ac
8、id in cells was determined by micromethod.K562 leukemia cellswere cultured in medium with or without glutamine and cell counting method was used to detect cell doublingtime(DT)changes.Results:Lip-1 concentration-dependent manner inhibited the proliferation of K562 leukemiacells.Compared with the con
9、trol group,the gene andprotein expressions of CDKN1A and SLC7A11 inlow and high concentration groups increased(P*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.81660025）通信作者收稿日期：2022-10-28 39基础研究广西医科大学学报2023 Jan；40（1）0.05);the intracellular glutamicacid content in high concentration group decreased(P0.05);G1/S block oc-curre
10、d in low concentration group,while both G1/S and G2/M block co-existed in high concentration group.TheDT of K562 leukemia cells cultured in glutamine-free medium was higher than that in glutamine-containinggroup(P0.05).Conclusion:Lip-1 can inhibite the proliferation of K562 leukemia cells,and its me
11、chanismmay be related to deprivation of glutamicacid acid caused by the increased expression of SLC7A11 and cell cyclearrest caused by the increased expression of CDKN1A.KeywordsLiproxstatin-1;leukemia;glutamic acid;cell cycle arrest白血病是一种起源于造血系统的异质性疾病，常常表现为肿瘤细胞的恶性克隆性增殖及细胞分裂失调控1。尽管随着对于白血病发病机制和治疗策略研究
12、的不断进展，中国白血病患者的年龄标化5 年相对生存率从 20032005 年的 19.6%增长到20122015年的25.4%2，白血病仍是预后较差的疾病之一。化疗是白血病治疗的主要手段，然而传统化疗药物的长期使用会不可避免地导致副作用和耐药性，因此亟需新的治疗药物来改善预后。细胞周期指细胞从上一次分裂完成至下一次分裂结束的过程，包括分裂间期和分裂期。分裂间期包括 DNA 合成前期（G1）、DNA 合成期（S）和DNA合成后期（G2）3。细胞周期主要受细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）及其抑制物CKIs的调控。在细胞周期进程中共有3个“检查点”：G1检查点、分裂
13、中期（M）检查点和G2/M检查点，检查点失控会导致细胞增殖失调控4-5。白血病经典治疗药物阿糖胞苷是核苷类似物，可作为S期特异性药物使白血病细胞发生G1/S阻滞6；长春新碱是微管去稳定剂，可作为M期特异性阻滞药物使白血病细胞发生G2/M阻滞7。由于细胞增殖失控是肿瘤细胞的主要特征之一，药物干预细胞周期进程一直以来是化疗药物的研究热点8。Liproxstatin-1（Lip-1）是一种喹喔啉类螺环化合物的衍生物，在2014年作为铁死亡抑制剂从小分子化合物库中筛选获得9。本课题组前期研究发现，Lip-1可以显著抑制白血病肿瘤细胞的增殖10，但其作用机制尚未明确。本研究通过Lip-1体外处理白血病细
14、胞株K562，观察转录组测序结果、细胞周期时相变化及谷氨酸含量，评价Lip-1对K562细胞增殖抑制的影响，并初步探讨其可能的分子机制。1材料与方法1.1细胞与主要试剂人白血病K562细胞株购于中国普诺赛公司，并由苏州鉴达公司鉴定正确。Lip-1购于美国Selleck公司，其化学结构式见图1；将5 mg的Lip-1溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，浓度 为 10 mmol/L。含 谷 氨 酰 胺 的 1640 培 养 基（11835-030）、不含谷氨酰胺的培养基（21870-076）均购于美国赛默飞公司；胎牛血清（FBS）购于美国Gemini公司；CCK-8检测试剂盒、RIPA、ECL发光液均
15、购于中国美仑；细胞周期试剂盒购于中国联科生物；谷氨酸含量检测试剂盒购于中国索莱宝公司；RNAsio PLUS-Trizol、无酶水、PrimeScript RT Re-agent Kit、TB Green Premix Ex Taq均购于日本Ta-kara；氯仿、无水乙醇购于中国天津大茂；柱式RNA抽提试剂盒购于中国生工；蛋白酶抑制剂购于美国MCE；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂-1A（CD-KN1A）抗体购于中国 Abclonal；-tubulin抗体、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）抗体、HRP标记山羊抗鼠兔抗体均由中国Abmart公司提供。图1Lip-1化学结构式1.2细胞培养与分
16、组将K562细胞培养于含10%FBS、0.2%谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基，置于37、5%CO2培养箱中。取对数生长期的K562细胞，以2105个/mL的细胞密度接种于6孔板中，分为3组：对照组（未经任何处理的K562细胞）、低浓度组（10 mol/L Lip-1处理24 h的K562细胞）和高浓度组（20 mol/L Lip-1处理24 h的K562细胞）。1.3CCK-8法检测细胞活力将处于对数生长期的K562细胞以1104个/孔的密度重悬于100 L含谷氨酰胺的完全培养基中，分别用不同浓度的Lip-1 40（2mol/L、4mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L）处理24 h，随后添加10 L CCK-8溶液，37 避光孵育3 h后用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的吸光度（OD）值。细胞活力（%）=（实验组OD值空白组OD值）/（对照组OD值空白组OD值）100%。1.4二代测序法分析细胞转录组表达差异用TRIzol提取各组细胞RNA，送至上海天昊生物科技公司进行mRNA二代测序。以TruSeq RNA SamplePreparation Kit