1、分子诊断与治疗杂志2023年1月第15卷第1期J Mol Diagn Ther,January 2023,Vol.15No.1论著基金项目：湖北省自然科学基金面上项目（一般面上）（2020CFB634）作者单位：武汉大学中南医院肾内科，湖北，武汉 430071通信作者：连欢，Email：LncRNA CASC7/miR21/Wnt2b 轴介导糖尿病肾病小鼠肾纤维化的机制研究连欢魏小宝张娟摘要 目的探究 miR21 靶向调控肾纤维化的发生发展机制，为临床糖尿病肾病（DN）的治疗提供新的思路。方法24 只 C57BLKS/JLeprdb/db 小鼠随机分为实验 1 组、实验 2 组与对照组，每组
2、8只。实验 1 组进行单侧肾切除术，术后 2 月，实验 1 组和实验 2 组小鼠采用腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法建立糖尿病肾病动物模型。HE 染色法观察肾组织病理学改变，Masson 染色法观察肾组织纤维化状况，qRTPCR 法检测各组肾组织中 LncRNA CASC7、miR21、Wnt2b、SMAD7 表达水平，western blot 法检测Wnt2b 和 SMAD7 的蛋白表达水平，荧光素酶报告系统鉴定 LncRNA CASC7 和 miR21 靶向关系。Pearson相关性分析肾组织中 LncRNA CASC7 和 miR21 的表达水平与糖尿病肾病肾纤维化之间的关系。结果染色
3、试验中观察到实验 1 组与实验 2 组小鼠肾小球肥大，系膜细胞及系膜基质增生，肾小管上皮细胞空泡变性。肾组织存在炎性细胞浸润、肾小管萎缩与间质纤维化。肾组织纤维化评分：实验 1 组（2.870.66）分实验 2 组（2.170.62）分对照组（0.570.14）分，差异有统计学意义（P0.05）；LncRNA CASC7、miR21、Wnt2b、SMAD7 表达水平：实验 1 组实验 2 组对照组，差异有统计学意义（P0.05）；与对照组相比，实验 1 组和实验 2 组 Wnt2b 和 SMAD7 蛋白表达均升高，且实验 1 组高于实验 2 组，差异有统计学意义（P0.05）；荧光素酶报告表明
4、 LncRNA CASC7 可与 miR21 靶向结合。Pearson 相关性分析结果显示，肾组织中 LncRNA CASC7 和 miR21 的表达水平与糖尿病肾病肾纤维化呈正相关（r=0.412、0.371，P 均 experimental group 2（2.170.62）control group（0.570.14）（P experimental group 2 control group，the difference was statistically significant（P0.05）.Compared with the control group，the protein exp
5、ressions of Wnt2b and SMAD7 inthe experimental group 1 and the experimental group 2 were increased，and the experimental group 1 was higher than the experimental group 2，the difference was statistically significant（P0.05）.A luciferase reporter indicated that LncRNA CASC7 could target miR21.The result
6、s of Pearson correlation analysis showed that the expression levels of LncRNA CASC7 and miR21 in kidney tissue were positively correlated with renal fibrosis indiabetic nephropathy（r=0.412，0.371，P7.0 mmol/L 的小鼠则认为造模成功。1.3.2HE 及 Masson 染色观察肾组织病理学改变与肾组织纤维化状况3 组小鼠肾组织用 4%多聚甲醛固定 48 h 后。常规行脱水、透明、浸蜡、包埋后。切成
7、5 m厚度石蜡切片，随后行贴片、脱蜡、水化、HE染色及Masson染色和封片等步骤，在生物显微镜下阅片并拍照观察各组小鼠肾组织病理学改变与肾组织纤维化状况。结果判读5：每个切片选择5个区域，在任何区域计算间质纤维化病变的面积，并对纤维化程度进行评分：0 为完全无纤维化，1 为纤维化区域50%。1.3.3qRTPCR 法检测各组肾组织中 LncRNACASC7、miR21、Wnt2b、SMAD7表达水平用 TRIzol 试剂提取各组大鼠肾脏组织中的总RNA，用反转录试剂盒将总 RNA 反转录为 cDNA文库，进行 qRTPCR 检测。反应条件为：95预变性3 min，95 20 s，55 20
8、s，72 20 s，共45个循环。引物序列见表 1。以甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，计算各组小鼠肾组织中LncRNACASC7、miR21、Wnt2b、SMAD7的相对表达量。1.3.4Western blot 法检测 Wnt2b 和 SMAD7 的蛋白表达水平配制电泳缓冲液与转膜缓冲液后，在转印夹板中依次放入海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵。将转膜槽放入 4冰箱，转膜 120 min。转膜结束后取出 PVDF 膜，直接进行封闭。一抗孵育：用 5%BSA 的 TBS/T 稀释一抗（一抗有 Wnt2b、SMAD7），4孵育过夜；漂洗后用 TBST 稀释 HRP标记的二抗（1
9、1 000），室温孵育 1 小时；显影：将显色液均匀滴在PVDF膜上，确保显色液覆盖整张膜，在暗室内显影后拍照。1.3.5荧光素酶活性检测报告质粒与 miRNA 共转染 24 h 后，用 PBS 轻柔洗两遍，加入 100 mL 新鲜配置的裂解液，摇床上裂解细胞 15 min；将细胞裂解液收集于 EP 管，4 12 000 rpm 离心（离心半径 15 cm）10 min，取20 m1 上清于另一新 EP 管中备用，PCR 扩增含miR21结合位点的 CASC7 的 3UTR 序列，分别构建 CASC7 野生型质粒和突变型质粒。双荧光素酶报告基因检测分析仪检测荧光素酶活性。1.4统计学方法采用
10、SPSS Statistics 21 统计学软件进行分析。计量资料以（x s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。采用 Pearson 相关性分析肾组织中 LncRNA CASC7 和 miR21 的表达水平与糖尿病肾病肾纤维化之间的关系，以相关系数r 表示两资料间的相关性。P实验2组（2.170.62）分对照组（0.570.14）分（P实验2组对照组（P0.05）。见表2。2.3Wnt2b和SMAD7的蛋白表达水平与对照组相比，实验 1 组和实验 2 组 Wnt2b 和SMAD7 蛋白表达均升高，且实验 1 组高于实验 2组（P0.05）。见图3。2.4LncRNA CASC7与 miR21
11、的靶向关系验证miR21 可降低 LncRNA CASC7 的荧光素酶活性（P0.05），表明 LncRNA CASC7 可与 miR21靶向结合。见表3。2.5肾组织中LncRNA CASC7和miR21的表达水平与糖尿病肾病肾纤维化的相关性Pearson 相 关 性 分 析 结 果 显 示，肾 组 织 中LncRNA CASC7 和 miR21 的表达水平与糖尿病肾病肾纤维化呈正相关（r=0.412、0.371，P 均0.05）。3讨论miRNA 在与其目标基因 3非编码区域结合后，通过诱导 mRNA 退化和（或）抑制 mRNA 蛋白质合成，负调控目标基因的表达。越来越多的证据表明，miR
12、NA 的调节不力可能与 DN 的发病机制和发展有关6。本研究着重探讨了 LncRNACASC7/miR21/Wnt2b 轴对 DN 进展的调控，旨在丰富 DN 发病分子机制的理论，为临床 DN 疾病的诊治提供更多潜在的生物学标志物。本研究中采用 db/db 小鼠构建 DN 模型，该基因缺陷小鼠与人类 DN 表现出相似的特征，出现肾组织炎性浸润、肾小管萎缩与间质纤维化等，8 周龄的 db/db 小鼠经高糖脂喂养可发展至DN 的早期阶段7。实验首先证实了 LncRNACASC7、miR21、Wnt2b、SMAD7 表达水平在 DN 模型小鼠中表达上升，表明 LncRNA CASC7、miR21可能
13、与 DN 的发生发展密切相关。长期高血糖水平可诱发细胞炎症与纤维化，而炎症反应和纤维化是肾炎的主要病理表型，是导致肾功能障碍的重要因素8。因此本研究中肾组织纤维化评分由高到低依次为实验 1 组、实验 2 组、对照组，说明随着糖尿病肾病进展，肾纤维化程度可能会逐渐加重。陈桐等9的研究表明，随着 DN 分级的进展，患者 24 h 尿蛋白量逐渐增多，血清 LncRNAGAS5 与 miR21 的表达也上调。为了验证 LncRNA CASC7 调控的下游靶分子，随后研究中验证了 LncRNA CASC7 与 miR21 的非编码区域存在靶向结合位点，荧光素酶报告表明LncRNA CASC7 可与 mi
14、R21 靶向结合。同时通过western blot 检测与 Pearson 相关性分析发现与对照组相比，实验 1 组和实验 2 组 Wnt2b 和 SMAD7组别实验 1 组实验 2 组对照组F 值P 值n888IncRNA CASC70.320.10ab0.240.07a0.150.0410.5210.001miR211.860.47ab1.420.41a0.640.3717.4210.001Wnt2b1.480.26ab1.220.32a0.350.0448.9840.001SMAD70.890.15ab0.690.13a0.210.0471.4930.001注：与对照组比较，aP0.05
15、；与实验 2 组比较，bP0.05。表2各组肾组织中LncRNA CASC7、miR21、Wnt2b、SMAD7表达水平比较（xs）Table 2Comparison of the expression levels of LncRNACASC7，miR21，Wnt2b and SMAD7 in renal tissue of eachgroup（xs）Wnt2bSMAD744 kDa46 kDa实验 1 组实验 2 组对照组图3各组Wnt2b和SMAD7的蛋白表达情况Figure 3Protein expression of Wnt2b and SMAD7 in eachgroup组别实验
16、1 组实验 2 组对照组F 值P 值n888CASC7WT0.370.06ab0.450.09a1.040.07193.5900.001CASC7MUT0.960.110.980.091.020.061.4450.258注：与对照组比较，aP0.05；与实验 2 组比较，bP0.05。表3各组荧光素酶活性检测结果（xs）Table 3The detection results of luciferase activity in eachgroup（xs）63分子诊断与治疗杂志2023年1月第15卷第1期J Mol Diagn Ther,January 2023,Vol.15No.1蛋白表达均升高，且实验 1 组高于实验 2 组，Pearson 相 关 性 分 析 结 果 显 示，肾 组 织 中 LncRNACASC7 和 miR21 的表达水平与糖尿病肾病肾纤维化呈正相关。本项目于前期研究中发现，miR21在糖尿病肾病患者及糖尿病肾病纤维化动物模型的肾小管间质区高表达；TGF1 可上调 miR21 表达，后者进一步诱导细胞外基质、促纤维化基因的表达；miR21 靶向调控 WNT2B 和