1、2023 年 第 4 期 广 东 化 工 第 50 卷 总第 486 期 203 UPLC-MS/MS 法测定虾中法测定虾中 恩诺沙星含量的不确定度评估恩诺沙星含量的不确定度评估 尹青春1，陈小妹1，陈春泉1，肖璇1，李备1，魏静1，周凌聿1，梁成美2，高云慨1*(1海南省食品检验检测中心，国家市场监管重点实验室(热带果蔬质量与安全)，海南 海口 570314；2海南医学院热带医学院环境科学系，海南 海口 570000)摘 要目的：评定 UPLC-MS/MS 法测定虾中恩诺沙星检测结果的准确性。方法：采用 UPLC-MS/MS 法测定了虾中恩诺沙星，并通过建立的数学模型，对检测过程中引入的各个
2、不确定度进行了评估。结果：影响虾中恩诺沙星检测结果的不确定度主要因素是使用的仪器、配制标准溶液、配制标准曲线等。结论：当 2 个虾中恩诺沙星测定结果分别为 346.9 g/kg、1664.4 g/kg 时，其扩展不确定度分别为 48.8 g/kg、231.9 g/kg，结果表示为 346.948.8 g/kg、1664.4231.9 g/kg，k=2。本研究可为科学评价 UPLC-MS/MS 法测定虾中抗生素残留的准确性提供参考。关键词计量学；超高效液相色谱-串联质谱法；虾；恩诺沙星；不确定度；评定 中图分类号TS 文献标识码A 文章编号1007-1865(2023)04-0203-04 Un
3、certainty Evaluation for Determination of Enrofloxacin in Shrimp by Ultra-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry Yin Qingchun1,Chen Xiaomei1,Chen Chunquan1,Xiao Xuan1,Li Bei1,Wei Jing1,Zhou Lingyu1,Liang Chengmei2,Gao Yunkai1*(1.Hainan Institute for Food Control,Key Laboratory of
4、 Tropical Fruits and Vegetables Quality and Safety for State Market Regulation,Haikou 570314；2.Department of Environmental Science,School of Tropical Medicine,Hainan Medical University,Hainan 570000,China)Abstract:Objective In order to comprehensively evaluate the detection accuracy of.enrofloxacin
5、in shrimp.Methods Enrofloxacin in shrimp was determined by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).Each uncertainty was evaluated through the established mathematical models.Results The main sources of measurement uncertainties were preparation of standard soluti
6、on,preparation of standard curve and instrument.Conclusion The determination results of enrofloxacin in shrimps were 346.9 g/kg and 1664.4 g/kg,the expanded uncertainty were 48.8 g/kg and 231.9 g/kg,respectively.The results were represented as 346.948.8 g/kg,1664.4231.9 g/kg,k=2.This study could pro
7、vide a reference for the scientific evaluation of the accuracy of UPLC-MS/MS method in the determination of antibiotic residues in shrimp.Keywords:Metrology；UPLC-MS/MS；enrofloxacin；shrimp；uncertainty；evaluation 恩诺沙星(Enrofloxacin)是一种化学合成的抑菌剂，被广泛应用于水产疾病防治中1-3。恩诺沙星分解缓慢，易在水环境和水产品中残留，并通过食物链影响人类健康4-6。我国关于
8、虾中兽药残留的限量标准 GB31650-2019食品中兽药最大残留限量明确规定在虾中恩诺沙星残留(以恩诺沙星和环丙沙星之和计)不得超过 100 g/kg。近些年，国家食品安全监督抽检实施细则8将其列为重要的常规检测项目，虾等水产品中恩诺沙星检测超标现象仍然严重9-12。不确定度可反映测量结果准确性、可靠性，在日常检验中，经常会出现限值的临界值或不合格报告，需要进行不确定度的测量及评定13-15。本研究以建立的UPLC-MS/MS法测定2个复检虾样品中的恩诺沙星，然后依据不确定度相关标准和规定16-19，通过建立的数学模型，对该方法测定虾中恩诺沙星的不确定度进行分析与评估，得到影响不确定度的关键
9、因素。旨在为实际测定恩诺沙星的准确性、科学性提供理论依据，同时也可为测量其它抗生素残留的不确定度评定提供参考。1 材料与方法材料与方法 1.1 材料与试剂 恩诺沙星(1000 g/mL，天津阿尔塔公司)；恩诺沙星-D5(98.65%，德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司)；乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯，德国 Merck 公司)；Oasis PRiME HLB(200 mg，6 mL，美国 Waters 公司)。样品 1：基围虾，样品 2：竹节虾，均为海南省食品检验检测中心复检样。1.2 仪器与设备 AB 4500 三重四极杆质谱仪(ESI 源，美国 AB 公司)；Ultimate
10、3000 超高效液相色谱仪(美国 Thermo 公司)；Mettler MS1602S+RS-P26 型百分之一分析天平(Mettler Toledo 公司，美国)；UNIVERSAL 320R 高速冷冻离心机(Hettich 公司，德国)。1.3 实验方法 1.3.1 标准溶液的配制 恩诺沙星标准溶液：准确吸取 1000 g/mL 恩诺沙星标准溶液 1.0 mL，用甲醇定容至 10 mL，配制成 100.0 g/mL 恩诺沙星储备液；吸取 1.0 mL 100.0 g/mL 恩诺沙星储备液，用甲醇定容至 10 mL，稀释成 10.0 g/mL 恩诺沙星标准中间液；经相同方法稀释 1 次，最后
11、获得 1000 ng/mL 恩诺沙星标准使用溶液。所有标准使用溶液置于-18 冰箱冷藏保存。1.3.2 系列标准曲线配制 吸取适量恩诺沙星标准使用溶液，用 10%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)配制 2、5、10、20、80、100、200 ng/mL 恩诺沙星标准溶液。1.3.3 液相及质谱条件 液相条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 m，2.1 mm100 mm)，进样量：10.0 L，柱温：35；洗脱程序见表 1。质谱条件：ESI+离子源，MRM 扫描模式；恩诺沙星特征离子对：360.0/316.0(定量)，360.0/245.0(定性)；质谱参数见
12、表2。收稿日期 2022-08-25 基金项目 国家市场监管重点实验室(热带果蔬质量与安全)自主研究课题(ZZ-2002003)；海南省自然科学基金资助(321MS104)作者简介 尹青春(1986-)，女，内蒙古锡林郭勒盟人，高级工程师，硕士，研究方向为农产品质量与安全。*为通讯作者：高云慨(1988-)，男，海南乐东人，中级工程师，硕士，研究方向为食品质量与安全检测。广 东 化 工 2023 年 第 4 期 204 第 50 卷 总第 486 期 表表 1 洗脱程序洗脱程序 Tab.1 Elution procedure 时间/min 流速/(mL/min)流动相 A 0.1%甲酸水溶液/
13、%流动相 B 乙腈/%0 0.3 95 5 2 0.3 95 5 3 0.3 5 95 7 0.3 5 95 7.01 0.3 95 5 10 0.3 95 5 表表 2 质谱参数质谱参数 Tab.2 Parameters of mass spectrometer 项目 参数 电喷雾电压/kV 4.5 离子源温度/550 雾化气/psi 50 加热气/psi 50 气帘气/psi 25 碰撞室入口电压/V 10 1.3.4 样品前处理 称取搅拌均匀的虾肉5.0 g，加入含0.2%甲酸的80%乙腈水溶液10 mL，漩涡10 min，超声10 min，于转速为10000 r/min下离心 5 mi
14、n；取离心后的上清液 5.0 mL，过 PRiME HLB 柱净化除杂，取滤液 2.0 mL，于 40 水浴中氮吹近干，加入含0.2%甲酸的 10%乙腈水溶液 1.0 mL 复溶，过 0.22 m 有机相膜，作为待测液。1.3.5 样品加标试验 取虾阴性样品 6 份，加入 0.1 mL 1.0 g/mL 恩诺沙星标准中间液，加标浓度为 10 ng/mL。1.3.6 数学模型 测定样品中恩诺沙星含量的不确定度数学模型如以下公式所示：10001000c VXmF=式中：X-试样中恩诺沙星的含量，g/kg；c-测定液中恩诺沙星的浓度，ng/mL；V-定容体积，mL；m-试样的称样量，g；F-试样中恩
15、诺沙星的回收率。1.3.7 数据处理 数据采用 Excel 软件进行计算。2 结果与分析结果与分析 2.1 不确定度来源分析 通过方法验证学证明本方法适用于虾中恩诺沙星含量的测定，按照数学模型中各因素的分量，测量产生的不确定度来源于以下六个方面：标准品配制过程引入的不确定度分量；标准曲线配制引入的不确定度分量；样品前处理过程引入的不确定度分量；样品测量结果重复性引入的不确定度分量；方法回收率引入的不确定度分量；仪器测量引入的不确定度分量。图图 1 恩诺沙星测定的不确定度影响因素恩诺沙星测定的不确定度影响因素 Fig.1 Influencing factors of uncertainty in
16、 determination of enrofloxacin 2.2 不确定度的分析和评估 2.2.1 标准溶液配制引入的相对不确定度 U1 2.2.1.1 标准品纯度引入的相对不确定度 U1-1 恩诺沙星的纯度为99.9%，标准品证书中规定其扩展不确定度为5%(k=2)，由纯度20引入的相对不确定度：02502.02%9.99%5=1-1U。2.2.1.2 标准溶液配制引入的相对不确定度 U1-2 本实验所用标准品为恩诺沙星液体标准品，在配制恩诺沙星储备液及标准使用溶液等过程中，需要使用1 mL移液器(允差0.2%)3次，10 mL容量瓶(允差0.02 mL)3次，使用甲醇定容(体积膨胀系数为1.810-3/)，设定实验室温差为204，按照均匀分布(k=3)，配制过程中由移液器及容量瓶引入的相对标准不确定度，见表 3。因此，标准溶液配制引入的相对不确定度为：00725.000296.0300296.03332222=+=+=）（）（）（）（容量瓶移液枪UUU2-1 2.2.1.3 配制标准溶液合成相对不确定度 U1 02605.000725.002502.02222=+=+=）（）（