1、作者简介：万冬冬，男，副主任医师，主要从事呼吸系统肿瘤的研究。论著 下调 对非小细胞肺癌细胞的影响万冬冬，徐俊，储赏奇南通市海门区人民医院：肿瘤科；呼吸与危重症医学科，江苏南通 摘要：目的分析长链非编码 （）小核仁 宿主基因（）通过海绵化微小 （）对非小细胞肺癌（）细胞增殖、迁移及紫杉醇（）耐药的影响。方法体外培养人 细胞，随机转染不同质粒，分别记为 组、阴性对照（）组、抑制物（）组、抑制物阴性对照（）组、类似物（）组、阴性对照（）组。实时荧光定量 （）检测细胞中 、的表达；法检测细胞增殖及 敏感性；检测细胞迁移、侵袭；双荧光素酶报告实验检测 与 的靶向关系；法检测多药耐药相关蛋白（）、微小染
2、色体维持蛋白（）、水平。结果过表达 或抑制 表达后，细胞 值、迁移及侵袭细胞数、及 蛋白下降，细胞增殖抑制率及 蛋白水平升高（）。负调控 。上调 可逆转 过表达对 细胞 值、迁移、侵袭、增殖、蛋白的影响（）。结论 可通过靶向 抑制 细胞增殖、迁移、侵袭，提高 细胞 敏感性。关键词：长链非编码 小核仁 宿主基因；微小 ；非小细胞肺癌；增殖；迁移；紫杉醇耐药 ：中图法分类号：文章编号：（）文献标志码：，；，：（）（），（）（）（），（），（），（），；（），（），（），（），：；国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的最主要原因，每年导致 万人死亡。非小细
3、胞肺癌（）是最常见的肺癌类型，多数患者确诊时，通常处于晚期或已发生转移。紫杉醇（）是 常用化疗药物，但长期治疗后，部分患者可产生耐药性，严重影响化疗疗效。探讨 的 耐药机制，可为临床治疗提供新的思路，使更多患者从中受益。长链非编码（）在药敏、耐药肺癌细胞中异常表达，可能影响化疗耐药性。研究发现，小核仁 宿主基因（）是肝癌中的一种致癌 ，其在 癌组织中表达下 调，过 表 达 可 抑 制 细 胞 增殖。可作为竞争性内源性 （）与靶 竞争性结合对抗微小（），发挥海绵活性，抑制 功能，影响肿瘤的发生、发展。了解上述干扰方式，可为疾病发展及治疗提供新思路。在多种癌症中异常表达，的 数据库显示，在 中表达
4、上调。此外，数据库在线预测 与 存在结合位点，二者均在 中发挥调控作用，但与 耐药性的关系尚未可知。因此本研究通过分析 对 细胞增殖、迁移及 耐 药 性 的 影 响 及 可 能 机 制，以 期 为 逆 转 患者 耐药提供理论支持。材料与方法主要材料及仪器人 细胞株购自美国 公司；试剂盒（）、裂解液（）、蛋白浓度测定试剂盒（）购自上海碧云天生物技术有限公司；试剂盒（）购自美国 公司；多药耐药相关蛋白（）、微小染色体维持蛋白（）、兔单克隆抗体（、）购自英国 公司；试剂（）、反转录 试 剂 盒（）、试 剂（）购自美国 公司；紫杉醇注射液（国药准字 ）购自哈药集团有限公司；、阴 性 对 照（）、抑制物
5、（）、抑制物阴性对照（）、类似物、阴性对照（）质粒均由自上海吉玛制药技术有限公司提供。实时荧光定量 （）仪（型号：，美国 公司），酶标仪（型号：，美国 公司）；电泳仪、蛋白转膜装置（美国 公司）。方法细胞培养及分组在 培养液（含 链霉素、青霉素和 胎牛血清）中培养 细胞，、，细胞密度达 以上，传代培养。将对数期 细胞以 个孔接种于孔板中，试剂盒分别 或 同 时 将 、与 、与 质粒转染至 细 胞，记 为 组、组、组、组、组、组；每组个复孔。双荧光素酶报告实验验证 与 的靶向关系生物信息网站 预测，与 有结合片段。构建野生型 质粒，并利用基因定点突变技术构建突变型 质粒，由广州市锐博生物科技有限
6、公司 设计 合 成。将 、与 、共转染 细胞，采用 试剂盒检测各组 细胞荧光素酶活性。法检测细胞增殖及 敏感性细胞增殖：各组 细胞接种至 孔板（个孔），各孔加 培养液（含 胎牛血清），、培养，加 溶液（孔），培养，加 （孔），震荡 ，酶标仪测定 处吸光度值（），计算细胞增殖抑制率（对照组 实验组 ）对照组 。敏感性：分别在培养基中加入、，培养，其余步骤同细胞增殖。计算药物半数抑制浓度（）值。检测细胞迁移、侵袭迁移实验：采用无血清 培养液将各组 细胞密度调整为 个。小室上室加入细胞悬液 ，培养基（含 胎牛血清）加入下室中。培养，多聚甲醛固定、结晶紫染色，倒置显微镜下观察、记录穿膜细胞数。侵袭 实
7、 验：将 基 质 胶（无 血 清 培养液稀释）平铺于 小室上室，室温固化 ，其余步骤与迁移实验相同。检测 与 表达 法提取 细胞总 ，反转录试剂盒合成 。使用合成的 作为模板在荧光定量 仪 上 进 行 扩 增。反 应 体 系（）：、正向引物、反向引物、模板、。反 应 条 件：预变性 ，变性 ，退火 ，共 个循环；然后 延伸 。法分别计算 、相对于 、的表达水平。引物序列见表。国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，表引物序列检测项目上游引物（）下游引物（）法检测 、蛋白表达使用 裂解液提取各组 细胞总蛋白，法测定蛋白浓度后，取 蛋白上样，进 行 、转 膜、封 闭，加 入 、一抗（），孵育过夜，次日
8、加羊抗兔 二抗（），孵育，显色、拍照，分析各条带灰度值。统计学处理 软件对数据进行统计分析，检验数据的正态性和方差齐性，验证数据符合正态分布和方差齐性。计量资料以描述，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较行 检验。为差异有统计学意义。结果过表达 对 细胞增殖、迁移、侵袭、敏感性的影响 组 细胞 水平、迁移细胞数、侵袭细胞数、及 蛋白水平低于 组（），水平、细胞增殖抑制率及 蛋白水平高于 组（）。见表、图、。注：为细胞迁移实验；为细胞侵袭实验。图过表达 对 细胞迁移、侵袭的影响表过表达 对 细胞 水平、增殖、迁移、侵袭、敏感性的影响（，）组别 相对表达水平 水平细胞增殖抑制率（）（）迁移
9、细胞数（个）侵袭细胞数（个）组 组 注：；。图 检测 、蛋白表达下调 对 细胞增殖、迁移、侵袭、敏感性的影响 组 细胞 水平、值、迁移细胞数、侵袭细胞数、及 蛋白水平低于 组（），细胞增殖抑制率及 蛋白水平高于 组（）。见表及图、。靶向调控 表达 网站预测，与 存在结合位点，见图。双荧光素酶实验显示，共转染 的 细 胞 荧 光 素 酶 活 性 较 共 转 染 的 细胞高国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，（），见表。注：为细胞迁移实验；为细胞侵袭实验。图下调 对 细胞迁移、侵袭的影响表下调 对 细胞增殖、迁移、侵袭、敏感性的影响（，）组别 水平细胞增殖抑制率（）（）迁移细胞数（个）侵袭细胞数（
10、个）组 组 注：；。图 检测 、蛋白表达注：表示野生型；表示突变型。图 与 的靶向序列预测表荧光素酶活性检测（，）分组 组 组 过表达 可逆转 对 细胞增殖、迁移、侵袭、敏感性的影响 组 细 胞 水平、迁移细胞数、侵袭细胞数、及 蛋 白 水 平 高 于 组（），细胞增殖抑制率及 蛋 白 水 平 低 于 组（）。见表及图、。注：为细胞迁移实验；为细胞侵袭实验。图过表达 可逆转 对 细胞迁移、侵袭的影响国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，表过表达 可逆转 对 细胞增殖、迁移、侵袭、敏感性的影响（，）组别 水平细胞增殖抑制率（）（）迁移细胞数（个）侵袭细胞数（个）组 组 注：表示。图 检测 、蛋白表
11、达讨论 是肺癌的主要亚型，是全球癌症相关死亡的主要原因。主要包括肺鳞状细胞癌和肺腺癌两种亚型。近年来，靶向治疗及化疗等方面取得了一定的进展，但仍然只有不到 的 患者能够存活年以上。是第一个被确定的微管稳定剂，被认为是过去二十年化疗中最重要的进步，是使用最广泛的抗肿瘤药物之一，在多种癌症中具有广泛的活性，包括乳腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌和宫颈癌。临床治疗中 是晚期 的替代疗法，然而，内在的和获得性耐药经常出现在 治疗过程中，影响疗效。为了提高 的化疗效果，迫切需要探索其潜在的作用机制，并制定有效的策略来克服 对 的耐药性。多项研究表明，可在不同癌症的进展中发挥关键作用，并与肿瘤转移及耐药性相关。等
12、 研究发现，在 耐药细胞 中显著上调，抑制 表达可逆转 细胞的 抗性。等 研究 发 现，过 表 达 可 显 著 增 加 细胞对顺铂、吉非替尼、阿霉素和 等药物的化学抗性，可通过靶向 调节 细胞的化学耐药性。据报道，在多种人类癌症作为促癌基因发挥作用，能够促进骨肉瘤的细胞增殖和侵袭，且在肝细胞癌 和胃癌 中促进肿瘤发生发展。但 等研究结果则表明，在 中低表达，可能发挥抑癌作用。本研究中，过表达 后，细胞迁移及侵袭细胞数下降，细胞增殖抑制率升高，细胞增殖蛋白、抗凋亡蛋白 水平下降，促凋亡蛋白 水平升高，提示过表达 可抑制细胞增殖、迁移、侵袭，与 结果一致。等 研 究 证 实，通 过 海 绵 化 上
13、调 ，可能是前列腺癌细胞多西他赛耐药的分子机制。本研究显示，过表达 可降 低 细 胞 对 的 值，耐 药 蛋 白 水平下降，提示过表达 可提高 细胞的 敏感性。可 充 当 海 绵，从 而 调 节 靶 向 的稳定性，还可通过抑制 活性参与肿瘤耐药。文献 表明，可能通过靶向 调节 细胞的化学耐药性。文献 则显示，可通过海绵化 ，上调靶基因 的表达，参与前列腺癌多西他赛耐药过程。为探讨 在 细胞 耐药性中的可能作用机制，本研究首先通过 网站搜索发现，与 存在互补序列，双荧光素酶实验进一步证实，可靶向调控 。位于人类染色体 上，参与各种疾病的病理生理学过程。最近的研究表明，在多种癌症中作为抑制因子发挥
14、作用，在乳腺癌、结直肠癌、神经胶质瘤、肝细胞癌、骨肉 瘤、鼻咽 癌 下 调。本研究中，抑制 表达可降低 细胞增殖、迁移及侵袭能力，提示 在 中发挥促癌作用，与其在多数癌症中的作用相反。推测造成这种现象的原因可能与癌症类型以及 下游靶基因不同有关，在后续的研究中将从其下游基因入手进行深入分析。此外，过表达可增加乳腺癌细胞对阿霉素的治疗敏感性。本研究结果表明，抑制 表达，可降低 细胞对 的 值及 水平，表明抑制 可提高 细胞的 敏感性。进一步分析显示，过表达 可下调 表达，而过表达 可逆转过表达 对 细胞 值、迁移、侵袭、增殖、蛋白的影响，提示 可通过靶向 提高 细胞的 敏感性。有报道称，可通过靶
15、向抑制鼻咽癌中国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，的 抑制细胞侵袭和迁移；在宫颈癌中，直接靶向 调控癌细胞的增殖、迁移和侵袭。其中，已被鉴定为多种癌症的候选癌基因，过度表达 的肺肿瘤患者显示出生存率下降的趋势；是否参与 对 的调控作用还未可知，在未来的研究中将对此进行深入分析。综上所述，过表达 可抑制 细胞增殖、迁移、侵袭，增加 细胞对 的敏感性，可能通过靶向 发挥作用。参考文献 ，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：修回日期：）国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，