1、 CHINA MEDICINE AND PHARMACY Vol.13 No.2 January 202339 2023年1月第13卷第2期综 述BRCA基因检测进展林司杭周文斌暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院甲乳外科，广东深圳518020 摘要 研究表明，BRCA1/2 基因突变是遗传性乳腺癌/卵巢癌综合征的主要致病因素，可导致乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌及前列腺癌等风险显著增加。BRCA 基因检测可帮助临床进行准确的治疗和判断预后、评估家属遗传风险，有助于采取预防性手术等。目前国内 BRCA 基因检测的有三代测序技术，每一代又有许多检测平台，有各自的优缺点。国内外的 BRCA1/2
2、基因检测应用因为患病人群特征、仪器设备、医疗水平等因素而有所差异。本文综述 BRCA 基因检测的研究进展及临床应用。关键词 BRCA1；BRCA2；基因检测；二代测序 中图分类号 R730.5；R-1 文献标识码 A 文章编号 2095-0616（2023）02-0039-05Advances in BRCA gene testingLINSihangZHOUWenbinDepartment of Thyroid and Breast Surgery,the Second Clinical Medical College of Jinan University,Shenzhen People
3、s Hospital,Guangdong,Shenzhen 518020,ChinaAbstract Studies have shown that breast cancer susceptibility gene 1/2(BRCA1/2)fund mutation is a major causative factor in hereditary breast cancer/ovarian cancer syndrome,leading to a significantly increased risk of breast,ovarian,colon,pancreatic,and pros
4、tate cancers,etc.BRCA gene testing is helpful for accurate clinical treatment,evaluation of the prognosis,assessment of the genetic risk in family members,and application of preventive surgery,etc.Currently,there are three generations of BRCA gene sequencing technologies in China,and each has its ow
5、n advantages and disadvantages and is bound with many testing platforms.The application of BRCA1/2 gene testing in China and abroad varies depending on the characteristics of the patients,instrumentation,and medical level.This paper herein reviews the study advances and clinical applications of BRCA
6、 gene testing.Key words BRCA1;BRCA2;Gene testing;Second-generation sequencing 基金项目 广东省深圳市医学重点学科建设经费资助（No.SZXK015）。通讯作者BRCA1/2 基因突变可以导致乳腺癌、卵巢癌等风险增加。BRCA1 和 BRCA2 突变携带者患乳腺癌累积风险分别为 72%和 69%，对侧乳腺癌累积发病率分别高达 83%和 62%；15%22%的卵巢癌由BRCA1/2 基因突变导致，且终身危险度由 1%2%升至 60%70%；BRCA1/2 突变携带者的一级亲属患前列腺癌风险是正常人群 1.7 倍；故 BR
7、CA1/2基因检测对癌症的早期发现、预后等有重要意义1。目前携有 BRCA 突变癌症患者可从铂类药物 及 腺 苷 二 磷 酸 核 糖 聚 合 酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制剂等获益。研究表明铂类药物可延长 BRCA 突变携带者的无进展生存期。携带 BRCA1/2 胚系突变的三阴性乳腺癌患者对铂类药物较敏感，而对紫杉醇类药物有抗性。在期试验中，发现 BRCA1/2 胚系突变的三阴性乳腺癌患者对铂类药物客观反应率及无进展生存期均高于紫杉醇。2018 年 1 月美国批准奥拉帕尼（Olaparib）治疗携带 BRCA 突变的人表皮生长因子受体 2（epider
8、mal growth factor receptor 2，HER-2）阴性的转移性乳腺癌。期临床试验发现奥拉帕尼组可降低携有 BRCA1/2 突变的转移性激素受体阳性或三阴性乳腺癌患者 42%的疾病进展风险、延长无进展生存期约 2.8 个月2-3。BRCA1/2 基因检测技术历经了低通量的第一代测序、高通量二代测序，再到如今单分子第三代测序。三代测序在不同时代背景下开发出来，有各自优缺点。第一代测序尽管有成本高、低通量、应用局限等缺点，但目前仍为基因检测金标准。二代测序则弥补一代测序的不足，具备测序速度快、通量高等优势。但也存在短读长的技术短板。三代测序最大特点是能单分子测序，具有读长变长、测
9、序时间减少等优势。且不需进行 PCR 扩增，这能有效避免 PCR 偏好性导致的错误测序4-5。对于 BRCA 突变阳性患者，由于国内外人群特征、医疗水平、临床指南不同等原因，导致 BRCA1/2CHINA MEDICINE AND PHARMACY Vol.13 No.2 January 202340 2023年1月第13卷第2期综 述基因检测应用有所差异。笔者将综合阐述当前BRCA 基因应用的最新进展，从而可以更好地为精准医疗服务。1BRCA1/2变异测序技术的发展历程在过去的 20 年内，每一代基因测序在规模、通量等都有了极大的发展。1975 年 Frederick Sanger发明的“双
10、脱氧链终止法”及 Walter Gilbert 在 1977 年提出的“化学测序法”，意味着第一代测序出现。一代测序存在通量低、成本较高等问题，无法满足当前分子生物学等对于高通量、高效率、高产出的测序需求，从而衍生出如今的二代测序。2005年 Roche 公司推出以焦磷酸合成测序法为原理的 454 平台，其利用乳胶系统对 DNA 分子进行扩增，避免了传统方法的烦琐步骤，实现了大规模并行测序。Life Technologies 公司在 2008 年推出的半导体测序很快在外国测序市场响应，ABI 公司SOLiD 测序受其影响逐渐没落。华大基因作为中国本地测序公司，在 2014 年发明了二代测序仪器
11、BGISEQ-1000 型号，其优势体现在大规模 DNA 测序和小 RNA 分析，但转录组分析的性能仍需进一步完善6-8。2010 年前后，可满足长读长和快速测序的三代测序平台开始兴起。2008 年 Helicos Bioscience 公司发明的 Heliscope 测序平台以单分子测序技术为基础；同年，ONT 公司推出新型纳米孔单分子测序仪器，因为机器还不稳定，还需反复检测，故还不能投入市场；Pacific Bioscience 测序平台 2009 年发明的单分子实时测序技术可以对特定的模板进行检测，满足实时测序的需求9。2BRCA1/2一代基因测序平台原理和优缺点Sanger 测序法，又
12、称第一代测序技术，釆用直接测序的方法对各碱基荧光标记进行 DNA 序列分析，方法简便易行，结果直观。至今仍作为各基因突变检测方法的金标准。一代测序检测片段最长可达 800 1000 bp，且有很高精确度，可达 99.999%。一代测序由于对于长片段基因操作上较难实现、费时费力、消耗大量成本等问题，限制了其广泛应用。3BRCA1/2二代基因测序平台原理和优缺点下一代测序技术即二代测序，是当前适合BRCA 基因变异的检测技术。二代测序可未知序列时，对 DNA 片段进行测序；可同时检测多基因来指导肿瘤的早期预防及给予患者更加精准的个体化治疗。当前国内外二代测序平台参差不齐，有各自优劣势，在临床及基础
13、医学有不可替代的地位10-11。3.1Roche/454测序平台Roche 公司推出以边合成边测序技术为原理的454 焦磷酸测序，是当前第一台较为稳定的测序平台，其主要采用焦磷酸测序法。该项测序技术的测序原理大致为将模板进行 PCR 扩增后，与相应的引物、DNA 聚合酶等共同孵育进行酶促反应。在酶促反应中，会释放出焦磷酸基团和产生光信号，然后被电荷耦合元件光学系统捕捉并读取 DNA 序列信息。该平台精确度较高、耗时间较短和效率高。由于测序成本较高，限制了其在市场的普及。3.2Life/SOLiD测序平台SOLiD 平台原理为连接法和双碱基编码。在测序过程更换引物及替代了之前的聚合酶连接反应，双
14、碱基编码对测序错误进行校正，来提高测序的精准度。与 GS FLX 测序相像，在 PCR 扩增和构建文库上，都用磁珠接头来检测 DNA 序列。不一样的方面是 SOLiD 平台的磁珠比 GS FLX 小得多。当前 SOLiD 系统称其测序准确度大于 99.94%12。3.3Ion Torrent测序平台Ion Torrent 的核心技术为半导体技术。测序大致是将 DNA 链锚定在半导体芯片的微孔上，然后加入碱基，过程会释放出氢离子。通过对 H+的检测，实时判读碱基。Ion Torrent 平台可测定 DNA 片段的合成，减少了 CCD 扫描等操作，从而耗时短。检测 H+可以大大提高碱基判读精准性，
15、同时测序成本较低；其劣势为读长较短及测序准确率不高13。3.4华大基因CG平台CG 平台测序原理为 DNA 纳米芯片技术，测序大致为将 DNA 纳米球锚定在芯片上，然后通过探针锚定分子连接技术来检测 DNA 序列。CG 平台推出的从头拼接技术，能够检测等位基因杂合子突变，其灵敏性高；为降低探针和酶的浓度，平台利用的是组合探针锚定连接法技术。其优势为可一次性读取数个碱基，减少耗时。每次检测都不因前一次测序结果影响，所以不会出现错误累积。但读长较短是其不可避免的短板。3.5不同二代测序平台的比较分析不同二代测序平台各有特点，在通量、读长、准确率及成本等各有表现。罗氏454作为最早测序仪，读长较长，
16、运行较快。但成本较高、错误率也较高；SOLiD 测序仪用于外显子和基因突变测序，测序准确率较高，然而读长较短，运行较慢，目前已淡出市场；Ion Torrent 测序平台准确率较高，测序成本低，但读长较短。若单个碱基出现得多则产生许多的H+，使 pH 值降低，导致测序不精确；华大基因 CG CHINA MEDICINE AND PHARMACY Vol.13 No.2 January 202341 2023年1月第13卷第2期综 述平台碱基读取完全独立，可降低错误率，且价格低，不足之处为读长较短。4BRCA1/2三代基因测序平台原理和优缺点2008 年，三代测序技术诞生。弥补了第二代短读长，无法完整解析复杂重复序列的短板。三代测序不需要依赖 PCR 技术，测序压缩至数小时内。其最大特点为单分子测序技术。但目前仍处于技术发展期，其碱基识别准确度仍有较高错误率且成本较高，限制其大规模应用。目前国内外占主流的三代测序平台有 SMRT 测序、纳米孔 SMS 测序平台、SMS 测序平台及 SFRET 测序平台14-15。4.1Heliscope测序平台Helicos Bioscience 公司的单