1、基金项目：本研究由北京市自然科学基金面上项目(6212006)和科技创新服务能力建设-高精尖学科建设项目(PXM2019_014-207_00032)共同资助引用格式：Wang K.,Zhang Q.,and Dong Q.H.,2023,Function analysis of FaRALF1 in regulating fruit ripening of Benihoppe straw-berry,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(3):842-849.(王科,张卿,董清华,2023,FaRALF1 基因调控 红颜 草莓果实成
2、熟的功能分析,分子植物育种,21(3):842-849.)研究报告Research ReportFaRALF1 基因调控 红颜 草莓果实成熟的功能分析王科张卿*董清华*北京农学院植物科学技术学院,农业应用新技术北京市重点实验室,北京,102206*共同通信作者,;摘要多肽信号广泛存在于高等植物体内，并对植物的生长发育和果实成熟起重要的调控作用，为探究多肽信号调控植物果实成熟机制，本研究以八倍体 红颜 草莓(Fragariaananassa Benihoppe)为试验材料，通过生物信息学技术在草莓全基因组中鉴定出一类植物多肽信号家族 RALF(Rapid alkalinization facto
3、rs)，并根据染色体上的定位命名将其为 FaRALF1-FaRALF9，通过分析 FaRALFs 基因家族成员在草莓果实不同发育时期的表达差异，以及其对脱落酸(ABA)、生长素(IAA)、油菜素内酯(BR)、蔗糖处理(Suc)的响应特征分析，初步推测家族成员 FaRALF1 可能参与调控草莓果实成熟。通过构建 FaRALF1 基因的超表达 FaRALF1-OE(Over Expression)和 RNA 干扰 FaRALF1-RNAi(RNA interference)载体瞬时侵染大绿时期的草莓果实，通过体视荧光显微镜观察侵染 5 d 后草莓果实的荧光标签和成熟表型，并通过 RT-qPCR(Q
4、uantitative real-timePCR)分析基因表达量，其中 FaRALF1-OE 促进草莓果实成熟；相反，FaRALF1-RNAi 抑制果实成熟。本研究初步表明植物多肽信号家族成员 FaRALF1 基因参与调控 红颜 草莓果实成熟，且表达量与果实成熟程度呈正相关，为研究植物多肽信号调控果实成熟机理提供了基础。关键词草莓;快速碱化因子;果实成熟Function Analysis of FaRALF1 in Regulating Fruit Ripening of BenihoppeStrawberryWang KeZhang Qing*Dong Qinghua*Beijing Key
5、 Laboratory of New Technology in Agricultural Application,Plant Science and Technology Collage,Beijing University of Agriculture,Bei-jing,102206*Co-corresponding authors,;DOI:10.13271/j.mpb.021.000842AbstractPlant hormones and polypeptides signal widely exist in higher plants,and play an important r
6、ole in reg-ulating plant growth and fruit ripening.In order to explore the mechanism of peptide signaling regulating fruitripening in plants,we used octoploid strawberry(Fragariaananassa Benihoppe)as experimental material to identify a class of plant polypeptide signal family RALF(rapid alkalinizati
7、on)in the whole genome of strawberry bybioinformatics technology.By analyzing the expression differences of members of the FaRALFs family at differentdevelopmental stages of strawberry fruit and their response characteristics to abscisic acid(ABA),auxin(IAA),brassinolide(BR)and sucrose(Suc)treatment
8、,it is preliminarily speculated that FaRALF1 may be involved in reg-ulating strawberry fruit ripening.In this study,we constructed the over expression and RNA interference(RNAi)vectors of FaRALF1 to infect strawberry fruits in the big green stage.The fluorescent label and mature phenotypeof strawber
9、ry fruits were observed by stereoscopic fluorescence microscope after 5 days of infection,and the quan分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 3 期，第 842-849 页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.3,842-849titative real-time PCR(RT-qPCR)was used to detect the fluorescent label and mature phenotype of strawberryfruit
10、s PCR analysis showed that FaRALF1-OE promoted strawberry fruit ripening.On the contrary,FaRALF1-RNAi inhibited fruit ripening.This study preliminarily showed that FaRALF1,a member of plant polypeptide sig-naling family was involved in regulating fruit ripening of strawberry(Fragariaananassa Benihop
11、pe),and the ex-pression level was positively correlated with fruit ripening degree,which provided a basis for studying the mecha-nism of plant polypeptide signaling regulating fruit ripening.KeywordsStrawberry;RALF;Fruit ripening植物自身代谢产生了多种植物激素和多肽信号，这些信号分子形成的网络协同调控植物的各种生理活动(Pearce et al.,2001;Vanstr
12、aelen and Benkov,2012;Hirakawa and Sawa,2019)。目前已研究较深入的植物激素主要包括生长素(Auxins)、细胞分裂素(Cytokinins)、赤霉素(gibberellin,GA)、脱落酸(absc-isic acid,ABA)、乙烯(Ethylene)等，但多肽信号分子的发现至今仅有 30 年，其对于植物生长发育和果实成熟的研究较少且很多相关的分子机制尚不清晰。多肽信号分子主要包括 Systemin、ENOD40(EARLYNODULIN 40)、PSK(Phytosulfokine)、CLV3(CLAV-ATA3)、SP11/SCR(S-locu
13、sprotein11/S-locuscysteine-rich protein)和 RALF 等六类(Vanstraelen and Benk-ov,2012)。其中，RALF 是植物多肽超级大家族中的一个亚家族，在植物中广泛存在，已经在 51 种植物中得到鉴定(Campbell and Turner,2017)，其广泛分布在植物的营养和生殖器官，包括根、茎、叶、种子和花粉管等参与多种不同的生理活动调控(Murphy andde Smet,2014)，主要包括细胞膨大(Haruta et al.,2014)、侧根发育(Murphy and de Smet,2014)、根毛生长(Wuetal.,
14、2007)和花粉管伸长与受精(Geetal.,2017)等。RALF 家族包含了大量成员(Sharma et al.,2016)，但只有极少数 RALF 成员被鉴定出来，而对 RALF信号系统核心元件的鉴定和功能研究更是少之又少。目前，只有拟南芥 AtRLK1L 家族的 3 个成员FER、BUPS1 和 BUPS2 作为 RALF 信号分子的受体被鉴定和证实(Haruta et al.,2014;Du et al.,2016;Ge etal.,2017)。根据已有研究，RALF 信号在调控植物生长发育的功能研究中取得了一定进展，但其调控果实成熟相关的功能及机理，特别是在信号系统中起调控作用的关
15、键蛋白及其作用的分子机制仍不清楚。草莓作为典型的非呼吸跃变型果实，已经成为果树分子生物学研究的模式材料(Jia et al.,2011)。本研究在实验室前期研究基础上，从八倍体 红颜 草莓(Fragariaananassa Benihoppe)鉴定出植物多肽信号家族 RALF(Rapid alkalinization factors)，初步探究植物多肽 RALF 信号是否参与调控草莓果实成熟，为深入挖掘调控草莓果实发育和品质形成的基因资源奠定基础，对于通过基因工程创制草莓新品种具有重要意义。1结果与分析1.1红颜草莓FaRALF家族鉴定通过生物信息学技术，在草莓全基因组鉴定出 9个 RALF
16、家族成员(表 1)。根据在染色体的物理位置分别命名为 FaRALF1FaRALF9(图 1)，第 1、6、7 条染色体分别有 1 个家族成员，第 2、3、4 条染色体分别有 2 个家族成员，而第 5 条染色体没有发现家族成员。从 FaRALFs 蛋白基本信息中可知，FaRALF 家族成员开放阅读框长度在 102134 之间，其中 FaR-ALF9 氨基酸数最多，为 134 个；分子量在 11 287(FaRALF3)15 460 kD(FaRALF9)之间；等电点在6.79.82 之间，其中，FaRALF4 为弱酸性蛋白，其余成员均为碱性蛋白；亲水系数的范围从-0.673 到-0.008，其中亲水性最强的为 FaRALF6；不稳定指数从 29.9354.70，其中最不稳定的为家族成员为 FaR-ALF2，而最稳定的为 FaRALF7。FaRALF 家族成员的理化参数的获取为深入研究家族成员蛋白表达、纯化和功能提供依据。1.2草莓FaRALF家族对激素的响应特征为探究 FaRALF 家族对果实成熟的调控功能，本研究选择已被证实为对草莓果实成熟具有调控功能的 4 种激素信号物质(ABA,I