1、第 卷第期 年 月福建医科大学学报 与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病机制卢欣栎，黄淑娜，林杰，李爱娜，徐兴燕，杨乐，郭剑辉，吴思英摘要：目的探讨 、和人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（）在冠状动脉粥样硬化性心脏病（）患者及内皮细胞功能障碍中的表达变化及意义。方法基于基因芯片初筛（）和靶点预测，选择 及其潜在的下游靶点 和 做进一步的病例对照样本验证（）。体外培养原代人脐静脉内皮细胞（）和细胞系（），采用不同质量浓度的氧化低密度脂蛋白（，、和 ）诱导内皮细胞功能障碍，采用 （）法检测细胞增殖活力，采用乳酸脱氢酶（）试剂盒测定 活性，采用实时荧光定量聚合酶链反应（）检测细胞间黏附分子（）、转化生长因子（）
2、、和 的表达情况。结果患者的 表达上调，且与 呈负相关、与 呈正相关（均 ）。可降低 和 的细胞活力（其中 先升高后降低，），可升高 活性、和 的表达（）。在低浓度 诱导的 和 功能障碍中，和 表达均上调（），表达下调（）。结论 、和 在患者和低浓度 导致的 和 功能障碍中表达均异常，可能与发生、发展密切相关的内皮细胞障碍有关。关键词：冠状动脉粥样硬化性心脏病；环状；微小；血管内皮细胞；氧化低密度脂蛋白文献标志码：文章编号：（）收稿日期：资助项目：国家自然科学基金项目（）；福建省科技创新联合资金项目（）作者单位：福建医科大学 公共卫生学院流行病与卫生统计学系，福州 ；福建医科大学 附属第一医院
3、临床研究与转化中心，福州 ；福建医科大学 附属第二医院医务部，泉州 ；福建医科大学 附属第一医院心内科，福州 作者简介：卢欣栎，女，福建医科大学 级公共卫生专业硕士研究生通信作者：吴思英 ：目前，我国约有冠状动脉粥样硬化性心脏病（，）患者 万，其患病率和死亡率均处于持续上升阶段。的负担已成为重大的公共卫生问题。除了传统危险因素外，积极探索的分子学病因，进一步明确的发病机制，对于建立精准诊疗手段具有重要的意义。近年来，环状（，）作为一类特殊类型的非编码，可直接或间接参与的发生、发展。同时，因具有广泛表达、高度保守、组织特异和不易被核糖核酸酶裂解等特性，有望成为预防、诊断与治疗的新靶点。课题组前期
4、基于基因芯片初筛和病例对照样本验证发现，、和人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（，）在患者的外周血单核细胞中表达异常，且三者结合具有较好的诊断效能，但其潜在机 制 尚 不 明 确。内 皮 功 能 障 碍 被 认 为 是发病关键的第一步，研究发现，轴可调节内皮细胞增殖、迁移和凋亡并影响血管生成，从而参与心血管疾病的发生、发展，但 在内皮功能障碍中的表达情况仍待探究。氧化低密度脂蛋白（，）由低密度脂蛋白在体内发生氧化修饰而成，此反应与体内的氧化应激有关。笔者采用 诱导内皮细胞功能发生紊乱，并检测 、和 在内皮细胞功能障碍中的表达情况，为进一步揭示非编码 在 中的作用提供一定的理论依据和方向。对象与方法 对象
5、选取 年 月 年月在福建医科大学附属第一医院、福建医科大学附属协和医院 就 诊 的 患 者 为 研 究 对 象。纳 入 标 准：按 照 年 提出的 诊断标准，有或无心绞痛发作史，同时具备冠状动脉造影阳性（血管狭窄），并签署知情同意书者。同期选取在上述家医院的其他科室非各类型患者、非其他严第期卢欣栎，等：与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病机制重循环系统疾病患者作为对照组，排除严重的脑器质病变、严重的肾脏或肝脏疾病、精神病史或精神病家族史，或合并大面积心肌梗死伴血流动力学不稳定、恶性心律失常、严重心力衰竭、恶性肿瘤、内分泌系统疾病、近期感染其他重大疾病及不同意参加本研究者。本研究已获得福建医科大学生
6、物医学伦理委员会审定 伦理号 福医伦理审字第（）号，患者及家属均签署知情同意书。材料 实验细胞原代人脐静脉内皮细胞（，美 国 公司）；人脐静脉内皮细胞系（，北京协和医学院）。主要试剂与仪器 专用培养液（美国 公司）；培养液、胰酶 （美国 公司）；（高氧化，广州奕源生物科技有限公司，中山大学）；细胞计数（，）检测试剂盒（中国美伦生物公司）；细胞乳酸脱氢酶（，）活性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；（美国 公司）；、微小（，）和 逆转录试剂盒、引物和 试剂盒（日本 公司）；酶标仪（，美国 公 司）；微 量 紫 外 分 光 光 度 计（，英国 公司）；反转录仪（美国 ）；实时荧光定量聚合酶链反应
7、（，）检测仪（罗氏 ，瑞士罗氏 公司）。方法 基因芯片及病例对照样本验证课题组前期根据性别、年龄进行病例对照匹配，最终筛选出例患者作为病例组和例非 人员作为对照组。组间性别、年龄、文化程度、家族史、吸烟、饮酒、体质量指数（，）等分布比较，差别无统计学意义（）。提取病例和对照组外周血样品的 用于 、芯片表达谱的检测（委托博奥生物技术有限公司）。根据 病例和对照组性别、年龄进行匹配，最终筛选出 例 患者作为病例组及 例健康人员作为对照组 性别、年龄、婚姻状况、文化程度、吸烟情况、饮酒情况、腰围、腰臀比等比较，差别无统计学意义（），并提取外周血样品的 进行 、及 检测。细胞培养在显微镜下观察细胞形态
8、和生长状况，用滴管吸尽旧的培养液，并用培养基洗涤次，加 入 培 养 液（为 专 用 培 养 液；为液体培养基），放入 、体积分数为 的 培养箱，每天换液次。细胞传代当细胞生长状态良好且占比达到 时进行细胞传代。用滴管吸尽旧的培养液，培养基洗涤次，加入胰酶（，），作用数分钟，倒置显微镜下观察。当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸去胰酶，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量的新鲜培养基，以吸管上下吸放数次打散细胞团块，混和均匀后，按照传代比例（为；为 ）转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。处理细胞取处于对数生长期、生长状态良好的细胞，用培养基将细胞密度调整至 ，接入 孔板，每孔 细胞悬液；或用培养
9、基将细胞密度调整至 ，接入孔板，每孔 细胞悬液。后吸去原培养液，用不同质量浓度的 （用培养液将 原液稀释成、和 ）分别处理细胞，每个浓度条件下处理孔细胞，作为次生物学重复。检测用不同浓度 处理过的细胞（每个浓度条件下处理孔细胞，作为次生物学重复），培养 后吸去培养液，每孔加入含 的 培养液，后用酶标仪 进行检测。计算公式为：细胞活力（）（）：实验孔（含有细胞的培养基、待测药物）的吸光度；：对照孔（含有细胞的培养基、没有待测药物）的吸光度；：空白孔（不含细胞和待测药物的培养基、）的吸光度 活性检测用不同浓度 处理细胞（每个浓度条件下处理孔细胞，作为次生物学重复），培养 后，吸取细胞上清液用于 活
10、性检测。根据说明书进行操作。活性（）（测定孔 对照孔）（标准孔 空白孔）待测样本测定前稀释倍数 检测细胞间黏附分子（，）、转化生长因子（，）、，和 的表达情况用不同浓度 处理细胞（每个浓度条件下处理孔细胞，作为次生物学重复），培养 后，吸去培养液，每孔加入 磷酸盐缓冲液洗涤细胞次，倒去；每孔加入 ，充福建医科大学学报 年分吹打至 细 胞 裂 解。根 据 试 剂 盒 说 明 逆 转 录 成 ，在扩增仪上进行聚合酶链式反应，每个样品进行次平行检测，作为次的技术重复。反应结束后，所有的反应信息资料通过扩增仪收集并储存，采用 法分析。的引物序列见表。表 的引物序列 基因名称 序列（）-：实时荧光定量聚
11、合酶链反应；：人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶；：细胞间黏附分子；：转化生长因子。统计学处理采用 版本进行统计分 析，采 用 软 件 作 图，采 用 软件建立数据库。符合正态分布且方差齐的计量资料以描述（细胞实验数据经检验均呈正态分布）；组间比较用独立样本检验；多组间的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 检验，趋势性检验采用方差趋势性检验。病例对照的相关分析采用 相关检验。值均基于双侧检验，检验水准为 。结果 基因芯片及病例对照样本验证课题组前期研究基因芯片结果显示，病例与对照外周血有 条 、条 、条 差异表达 差异倍数（，），。本研究结合文献报道和生物信息学，采用 、等多种算法对筛选出的条
12、（、和 ）进行下游靶 （表）预测，根据结合位点数量，选择 进行 下游 预测，筛选出条可能与 结合的 （、）进行 验证（）。本研究结果显示，病例组 表达上调（为 ，），其潜在的下游靶点 表达下 调（为 ，），（为 ，）和 表达上调（为 ，），且其三者分别存在两两相关（，图），提示 （）轴与极有可能存在关联。根 据 相 关 系 数 大 小，最 终 选 择 进行细胞实验。表选择验证的 信息 与其具结合位点的 结合位点数量 功能紊乱模型的建立用不同浓度的 （、和 ）干 预 ，后检测细胞活力、活性及炎症因子的变化。结果显示，随着 浓度升高，细胞活力呈先升高后下降的趋势；相对于对照组，活性、和 在 干预的
13、 中表达水平升高，且呈现逐渐升高的趋势，在 质 量 浓 度 为 时 升 高 最 为 明 显（趋势性检验：，图），提示 可致 功能发生紊乱。第期卢欣栎，等：与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病机制 ：原癌基因丝氨酸苏氨酸蛋白激酶；：人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶。图 的相关关系图 、和 在 功能紊乱中的 表 达 水 平在 致 功能紊乱中，测定前期基于基因芯片及病例对照样本验证筛选的 的表达情况。与对照组比较，在低浓度 （）干预的 表达水平升高，在 浓度为 时表达水平升高，在 浓度 时表达水平降低（，图）。功能紊乱模型的建立选择细胞系 进 行 进 一 步 验 证。结 果 显 示，对 敏感度更高，在浓度为 和
14、 时细胞存活量低，因此在后续的实验中不考虑 这 个 浓 度；活 性 检 测 结 果 显 示，在 干 预 的 中 表 达 水 平 升 高（），在 浓度为 升高最为明显（），因此选择该浓度作为后续的实验浓度。炎症因子检测发现，和 表达水 平 均 升 高（）。以 上 结 果 提 示，可使 细胞功能发生障碍（图）。、和 在 功能紊乱中的表达水平检测 、和 在 致 功能紊乱中的表达情况。结果显示，与对照组比较，和 表达 水 平 均 升 高，表 达 水 平 下 降（），与 结果一致（图）。：氧化低密度脂蛋白；：细胞乳酸脱氢酶；：细胞间黏附分子；：转化生长因子；：人脐静脉内皮细胞。：细胞活力；：活性；：的相
15、对表达水平；：的相对表达水平。与对照组比较：，：，：。图不同浓度的 处理 细胞 后的细胞活力、活性及炎症因子的变化 ，福建医科大学学报 年 ：氧化低密度脂蛋白；：人聚腺苷二磷酸核糖聚合酶；：人脐静脉内皮细胞。：的相对表达水平；：的相对表达水平；：的相对表达水平。与对照组比较：，：，：。图不同浓度的 处理 细胞 后细胞 、和 的表达水平 ，：氧化低密度脂蛋白；：人脐静脉内皮细胞；：人脐静脉内皮细胞系；：细胞乳酸脱氢酶；：细胞间黏附分子；：转化生长因子。：细胞活力；：活性；：的相对表达水平；：的相对表达水平。与对照组比较：，：，：。图 处理 细胞 后细胞功能改变情况 ：氧化低密度脂蛋白；：人聚腺苷
16、二磷酸核糖聚合酶；：人脐静脉内皮细胞系。：的相对表达水平；：的相对表达水平；：的相对表达水平。与对照组比较：，：。图 处理 细胞 后细胞 、和 表达水平 ，第期卢欣栎，等：与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病机制讨论结合文献报道和生物信息学，本研究选定 并预测 下游可能结合的 ，结果显示 、是 最 重 要 的 靶 标。研 究 表 明，表达上调可造成血管内皮细胞坏死、凋亡等功能障碍，蛋白激酶在血管内皮细胞生长增殖中发挥重要作用，同时结合 、与 的 相 关 系 数，笔 者 选 定 轴 在内皮 细 胞 功 能障碍中进行探究，并解释、阐明该轴是否与其有关。本研究采用 干预 和 ，促使其功能发生障碍。已有研究 支持 能使 功 能 发 生 紊 乱，低 浓 度 （）能促进体外培养的 增殖，加速血管内皮层老化，从而促进早期动脉粥样硬化形成；而高浓度 （如 ）具有细胞毒性，可通过 通路诱导 的凋亡，与晚期的动脉粥样硬化有关。因此，为诱导内皮功能障碍及动脉粥样硬化形成，笔者课题组选择、和 作为 干预 的浓度。笔者团队采用 检测、和 个指标用于评价构建内皮细胞损伤模型成功与否。其中，是一类烟酰胺腺嘌呤二核苷（，