1、2023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023遗传育种遗传育种IDID3 3影响鸡卵泡发育与选择的分子机制影响鸡卵泡发育与选择的分子机制王丹，王方，张泽春，邹可欣，李艾欣，魏泽辉*（西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100）摘要：为探究DNA分化抑制因子3（ID3）影响卵泡选择的分子机制，试验观察比较了35周龄与75周龄京红1号蛋鸡卵泡形态、大小及数量差异，采用实时荧光定量PCR检测ID3在不同发育阶段卵泡中的表达，并通过CRISPRi技术与rhBMP2蛋白分别调控鸡小黄卵泡颗粒细胞中ID3的表达，检测卵泡选择相关基因卵泡刺激素受体（FSHR）与
2、类固醇生成急性调节蛋白（StAR）相对表达量。结果显示：35周龄京红1号蛋鸡等级卵泡数目显著高于75周龄蛋鸡（P0.05），但75周龄蛋Fx（F6/7）卵泡中ID3表达显著高于其他卵泡（P0.05），且75周龄蛋鸡的大白卵泡、小黄卵泡、Fx卵泡、F3卵泡、F1卵泡及卵巢基质中的ID3表达显著高于35周龄蛋鸡（P0.05）；通过CRISPRi抑制ID3表达时，FSHR与StAR的表达会显著增加（P0.05）；10、50、200 ng/mL rhBMP2能显著诱导ID3的表达（P0.05），FSHR与StAR的表达下降，但差异不显著。研究证实ID3与鸡卵泡发育选择密切相关，并明确其影响卵泡选择的分
3、子机制，对延长蛋鸡产蛋持久性具有重要意义。关键词：蛋鸡；卵泡选择；颗粒细胞；ID3；CRISPRi中图分类号：S831.2文献标识码：A文章编号：1004-6364（2023）02-01-07收稿日期：2022-02-28；修回日期：2022-04-07基金项目：国家自然科学基金项目（32172736）作者简介：王丹（1997-），女，硕士研究生，研究方向为动物生物技术，E-mail：*通讯作者：魏泽辉（1974-），男，博士，副教授，主要从事动物遗传育种研究，E-mail：doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2023.02.001Molecular Mechanism
4、 of ID3 Affecting Follicular Development andSelection in ChickenWANG Dan,WANG Fang,ZHANG Zechun,ZOU Kexin,LI Aixin,WEI Zehui*（College of Animal Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100）Abstract：To explore the mechanism that inhibitor of DNA binding and/or differentiati
5、on 3(ID3)affect follicular selection,this study compared the differences of follicle morphology and number of Jinghong No.1 laying hens at 35 and 75 weeks of age,and detected the ID3 gene expression in follicles at different developmental stages by real-time quantitative PCR.Furthermore,the expressi
6、on of ID3 gene in granulosa cells of small yellow follicles was perturbed by CRISPRi technology or rhBMP2 protein,and the expression of follicle selection-related genes follicle-stimulating hormone receptor(FSHR)and steoidogenic acute regulatory(StAR)were detected.The results showed that the number
7、of hierarchical follicles in Jinghong No.1 laying hens at 35 weeksof age was significantly higher than that in laying hens at 75 weeks of age(P0.05).The expression of ID3 gene in Fx follicles wassignificantly higher than that in other follicles(P0.05),and the ID3 gene expression in large white folli
8、cles,small yellow follicles,Fx(F6/7)follicles,F3follicles,F1follicles and ovary of laying hens at 75 weeks of age was significantlyhigher than that laying hens at 35 weeks of age(P0.05).When ID3 expression was inhibited by CRISPRi,the expressions ofFSHR and StAR were significantly increased(P0.05);1
9、0,50,and 200 ng/mL rhBMP2 could significantly induce the expression-12023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.2023遗传育种遗传育种产蛋性能是家禽重要的生产性状。鸡卵巢中卵泡的正常发育是维持其产蛋性能的重要条件1。蛋鸡在30周龄左右进入产蛋高峰期，此时产蛋性能最强，在72周龄左右时产蛋性能下降2。商品蛋鸡的卵泡能够维持周期性发育，且不断有卵泡成熟和排卵时，产蛋量较高3。成年母鸡卵巢中存在不同大小的卵泡，包括前等级卵泡（处于卵巢基质中且直径1 mm 的卵泡，16 mm 的白色卵泡，68 mm
10、小黄卵泡）与等级卵泡（从小到大分级为FxF1，Fx一般为F5或F6）4-5。由于等级卵泡很少发生闭锁，因此等级卵泡的数量对排卵和产蛋具有重要的影响6。为了维持等级卵泡序列，商品蛋鸡卵巢几乎每天选择一个小黄卵泡进入等级卵泡，这一过程被称为卵泡选择7。卵泡选择的过程伴随着卵泡颗粒细胞从未分化状态向分化状态的转变。因此，在卵泡发育过程中，颗粒细胞的增殖分化是卵泡选择的重要特征8。在卵泡选择前，来自前等级卵泡的鸡颗粒细胞保持未分化状态9。卵泡选择的关键标志就是小黄卵泡颗粒细胞层增强对卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone，FSH）的响应能力，卵泡由未分化状态向分化状态转变
11、，类固醇生成急性调节蛋白（Steroidogenic acute regulatory，StAR）表达增加。Miyoshi等10研究发现DNA分化抑制因子3（Inhibitor of DNA binding and/or differentiation 3，ID3）基因在小鼠卵巢卵泡的颗粒细胞和膜细胞中表达，且贯穿整个发育过程。ID 主要是基本螺旋-环-螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）转录因子家族的DNA结合抑制剂，家禽和哺乳动物一般包含ID1、ID2、ID3、ID4蛋白4种亚型。ID蛋白通过结合bHLH转录因子形成异源二聚体，从而阻止bHLH蛋白与含E-box反
12、应元件蛋白结合，可调节与细胞分化有关的基因表达11。ID3 蛋白是由 ID3 基因编码的一个DNA分化抑制因子的亚型12。是多个分化调控通路的显性负调节因子，是细胞增殖的正调节因子13，即具有促进细胞增殖与抑制细胞分化的作用14。有研究报道ID3蛋白在小鼠支持细胞内表达，并影响精子形成15。Johnson等16发现ID3蛋白与鸡颗粒细胞未分化表型相关，ID2蛋白与分化表型相关。Li等17发现在哺乳动物卵巢颗粒细胞中，转化生长因子1（Transforming growth factor-，TGF-1）家族成员会通过SMAD信号传导途径诱导ID3基因的上调调控基质金属蛋白酶1。Morgan等9通过
13、重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP2）促进SMAD1/5/9磷酸化，激活ErbB相关酪氨酸激酶，诱导了鸡颗粒细胞中ID3的表达。但ID3调控鸡卵泡发育与选择的分子机制研究尚未见报道。本试验通过检测ID3在35周龄与75周龄商品蛋鸡不同发育阶段卵泡中的表达情况，应用CRISPRi技术与rhBMP2蛋白调控鸡小黄卵泡颗粒细胞中ID3的表达，明确ID3与卵泡发育的关系，初步确立ID3影响鸡卵泡发育与选择的分子机制，对延长蛋鸡产蛋持久性具有重要意义。1材料与方法1.1试验动物34周龄和74周龄的京红1号蛋鸡各30只，购自陕西省扶风县某商品蛋鸡场，饲养环境与饲粮营养水平相同。购买后，按照原养鸡场相同的营
14、养标准饲喂，采用笼养方式，自由饮水，饲养1周，观察产蛋情况，当产蛋稳定后，将35周龄与75周龄京红1号蛋鸡各15只颈椎脱臼处死，迅速摘取完整卵巢，进行卵泡观察试验。鸡颗粒细胞分离试验所用均为35周龄京红1号蛋鸡。1.2试验试剂pX330a dCas9-eGFP质粒由西北农林科技大学动物基因组编辑实验室留存。质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；Liofectamine2000 Reagent购于美国赛默飞公司；细胞培养相关试剂购于陕西博达生物科技有限公司；RNAiso Plus、TB GreenPremix ExTaqTM定量试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司；Tra
15、nsScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；rhBMP2蛋白购于西安热默尔生物公司。of ID3(P0.05),but the expression regulation of FSHR and StAR was not significantly decreased.It was concluded that ID3 wasclosely related to follicular selection in chickens,and the molecular mechanism
16、 of its impact on follicular selection were clarified,which was of great significance for prolonging egg laying persistence in laying hens.Key words：layer;follicular selection;granulosa cells;ID3;CRISPRi-22023年第45卷第2期China Poultry Vol.45，No.2.20231.3试验方法1.3.1卵泡形态观察将产蛋稳定的35周龄和75周龄京红1号蛋鸡处死，摘取完整卵巢，将卵巢分为卵巢基质（Ovarg）、大白卵泡（直径 45.9 mm，LWF）、小黄卵泡（直径68 mm，SYF）及等级卵泡F1Fx（Fx是等级序列中最小的一个卵泡，根据不同鸡等级卵泡的数量，为F6或F7），观察35周龄与75周龄京红1号蛋鸡卵泡形态、等级卵泡数目。观察后将卵泡和卵巢基质转至冻存管中置于-80 保存，用于后续基因表达分析。1.3.2颗粒细胞的分离与培养摘取35周龄产蛋稳定的母鸡完整卵巢，分离6