1、 ，其他肝病 阳性的效应淋巴细胞参与 小鼠肝脏再生调控李丽何宇刘锴王萍基金项目：国家自然科学基金（）；王宝恩肝纤维化基金（）；国家新药研发重大专项（）作者单位：首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心通信作者：王萍，：【摘要】目的分析乙酰氨基芴联合部分肝切除（）小鼠肝脏再生模型肝组织中浸润的效应 淋巴细胞的变化情况。方法 小鼠每天应用 连续灌胃 后切除肝组织，术后继续每天应用 灌胃至术后 、。利用免疫荧光染色、蛋白免疫印迹检测肝脏前体细胞活化情况；采用多色免疫荧光染色与流式细胞术检测肝组织中效应淋巴细胞及其活化标志物 阳性细胞比例。结果 组小鼠术后 肝组织重量即可恢复至对照小鼠水平。肝组织中炎症细
2、胞浸润和纤维化不明显，但术后 时，肝脏汇管区中出现明显的炎症细胞浸润与细胞外基质沉积。随着术后时间延长，肝组织中 肝脏前体细胞数量逐渐增多，肝组织 蛋白表达水平亦显著增加。流式细胞分析结果显示，随着术后时间延长肝组织中浸润的 淋巴细胞的比例显著增加，术后 为对照组的 倍（），而糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（）阳性的 淋巴细胞比例呈先升高再降低的变化趋势，术后 、分别为对照组的 倍（）、倍（）。尽管术后 淋巴细胞比例无明显变化，但术后 时 阳性的 淋巴细胞比例显著降低，为对照组的 倍（）。结论 小鼠肝再生模型中伴随肝脏前体细胞的活化，效应淋巴细胞参与了小鼠的肝脏再生过程。【关键词】乙酰氨基芴
3、联合部分肝切除；肝脏前体细胞；糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体 ，.，：，：.【】（），（），DOI:10.14000/ki.issn.1008-1704.2023.01.001肝脏 年月第 卷第期【】；，肝脏是体内具有较强再生修复能力的器官，既可通过成熟肝实质细胞直接进入细胞周期完成肝脏的再生修复，也可以通过肝脏干前体细胞成熟分化为肝实质细胞完成再生修复。在慢性肝脏疾病中，反复的肝细胞损伤修复过程导致肝细胞增殖能力耗竭，起源于终末胆管的肝脏干前体细胞被活化，并成为主导肝脏再生修复的主要细胞类型。因此，探讨肝细胞增殖能力被抑制的情况下肝脏干前体细胞主导的再生修复过程，有助于进一步揭示慢性肝病情
4、况下肝脏的损伤修复的细胞分子机制。糖 皮 质 激 素 诱 导 的 肿 瘤 坏 死 因 子 受 体（，）主 要表达于活化的效应 淋巴细胞、调节性 细胞、自然杀伤细胞等，是效应淋巴细胞活化的一个标志物，与其配体（，）结合可作为协同刺激信号促进效应淋巴细胞增殖和细胞因子分泌。在 小鼠大脑中动脉闭塞卒中模型中，活化后通过提高促炎性细胞因子的水平，加重脑卒中后缺血性损伤程度，抑制 的表达可以提高脑卒中后神经前体细胞的存活。此外，在 小鼠单纯疱疹病毒型感染以及 小鼠卡拉胶致急性肺炎模型中的表达也上调，。而关于 在肝脏中的研究主要集中在肝移植术后、基因治疗后的患者免疫耐受与肝脏肿瘤的免疫治疗方面 ，在肝脏再
5、生修复过程中表达 的效应 淋巴细胞的变化情况尚不清楚。本研究采用经典的肝脏前体细胞活化模型 乙 酰 氨 基 芴 联 合 部 分 肝 切 除（，）模型，利用 有效阻断肝细胞增殖进而活化肝脏前体细胞，观察前体细胞主导的肝脏再生修复过程中效应 淋巴细胞比例的变化情况和 阳性效应 淋巴细胞比例的变化情况。材料和方法一、主要材料周龄雄性无特殊病原体（）级的 小鼠 只，体质量（），购自北京华阜康实验动物有限公司，购自美国 公司。免疫 荧 光 所 用 抗 原 封 闭 液 购 自 美 国 公司，免疫荧光和免疫印迹用 抗体购 自 美 国 公 司，标记驴抗兔 抗体购自美国 公司，化学发光液购自德国 公司。组织细胞
6、分离所用的胶原酶、购自瑞士罗氏公司，、多聚甲醛购自北京索莱宝科技有限公司，红细胞裂解液、标记 抗体、标记 抗体、标记 抗体、标记 抗体、标记 抗体购自美国 公司。二、小鼠 动物模型制备将 溶解于含 乙醇的玉米油中，浓度为 ，实验组小鼠连续 按 的剂量灌胃，对照组小鼠用相同体积玉米油灌胃。第天实施肝部分切除术，的戊巴比妥钠按 的剂量对小鼠进行腹腔注射麻醉，麻醉后取腹部正中切口，在距离肝门 处结扎并切除肝左外侧叶，保留中间叶、尾状叶和右侧叶，做部分肝切除。术后继续用 的 灌胃，分别于术后 、处死小鼠，收取肝组织。染色：将肝组织石蜡切片依次放入二甲苯和梯度酒精中脱蜡至水后，依次用苏木素、伊红进行细胞
7、核和细胞质染色，将切片依次放入梯度酒精和二甲苯中脱水透明，中性树胶封片，荧光显微镜观察拍照。天狼星红染色：将肝组织石蜡切片依次放入二甲苯和梯度酒精中脱蜡至水后，放入天狼猩红染液中染色 。将切片依次放入梯度酒精和二甲苯中脱水透明，中性树胶封片，荧光显微镜观察拍照。免疫荧光染色：石蜡包埋切片于 烤箱中 后，依次置于二甲苯、无水乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、中脱蜡水化。加入柠檬酸抗原修复液（）于高压锅中进行抗原热修复。待冷却后用 洗 去 抗 原 修 复 液，滴 加 抗 原 封 闭 液 室 温 封 闭 ，滴加 抗体（用抗体稀释液按 倍配制）后于孵育过夜。洗次切片后，加入 标记驴抗兔 抗体（用抗体稀释液按 倍
8、配制）室温孵育 ，洗去抗体后滴加含 的封片剂封片，荧光显微镜观察拍照。三、蛋白印迹检测 蛋白的表达 ，蛋白是肝脏前体细胞特异性标志物。取小鼠肝组织称重后剪碎，按 加入适量蛋白裂解液，匀浆器匀浆以提取蛋白，法测定蛋白浓度，按每孔蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后用 恒流电转将蛋白转印到硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜经含脱脂奶粉的 封闭 ，兔抗 抗体（倍稀释）或小鼠抗 抗体（倍稀释）摇床孵育过夜。洗膜次后，对应辣根过氧化物酶标记二抗（倍稀释）室温孵育 后，洗膜次，加入显色液显影，应用伯乐分子成像仪 （美国）的 软件（版本）拍照。四、流式细胞术检测肝脏组织浸润炎症细胞 是效应 淋巴细胞活化的标志。小鼠处
9、死后，氯化钠原位灌注至肝脏呈暗黄色以去除血液细胞，将肝组织剪成小块重悬于含 胶原酶和 的消化液中，匀浆器匀浆后于 水浴中消化 ，目滤网过滤后加入含胎牛血清的 终止酶的消化作用。离心 去除肝细胞沉淀后，上清液经 离心 ，将细胞沉淀重悬于 密度梯度离心液中，离心 获得非实质细胞。加入红细胞裂解液冰浴裂解红细胞，再加入 终止反应，离心 后弃上清，将细胞沉淀打散加入小鼠 防止非特异性染色后，再加入 标记 抗体、标记 抗体、标记 抗体、标记 抗体、标 记 抗 体 于 中 染 色 ，使 用 洗细胞一次后加入多聚甲醛固定细胞，应用 流式细胞仪（美国）检测，流式分析软件分析。五、统计学方法应用 软件（版本）进
10、行统计学分析。正态分布的计量资料以?表示，比较采用检验，为差异有统计学意义。结果一、损伤后肝组织的病理变化 小鼠在 造模后，随着术后恢复时间增加，肝中间叶体积显著增大，肝右叶以及尾状叶体积轻度增大。对照组小鼠（）肝脏重量为（），实验组小鼠术后 （）肝脏重量为（），术 后 （）肝 脏 重 量 为（），与对照组小鼠相比差异均无统计学意义（均 ）。与此同时，对照组小鼠肝脏与体重比为（），术后 、分别为（）、（），与对照组小鼠相比差异均无统计学意义（均 ）。染色结果显示，术后 肝组织内未见明显的炎症细胞浸润，术后 ，汇管区出现明显的炎症细胞浸润。天狼星红染色结果显示术后 肝组织中无明显细胞外基质沉积，
11、而术后 汇管区周围出现明显的细胞外基质沉积。见图。图小鼠 模型肝组织的病理变化：对照组小鼠（）；：实验组小鼠术后 （）；：实验组小鼠术后 ；：对照组小鼠（）；：实验组小鼠（）；：实验组小鼠（）肝脏 年月第 卷第期二、模型活化肝脏前体细胞肝组织免疫荧光染色显示与对照组小鼠（）相比，术后 （）、（）时，细胞数量呈明显的时间依赖性增加（图）。蛋白质印迹结果也显示 术后 、时，表达亦显著增加（图），表明 模型活化了肝脏前体细胞。图小鼠 模型活化肝脏前体细胞肝组织免疫荧光染色示 细胞数量呈时间依赖性增加；蛋白印迹示 表达量在术后 明显增加三、肝再生模型中 淋巴细胞比例显著增加利用胶原酶消化和 密度梯度离
12、心的方法获得肝脏非实质细胞，经多色免疫荧光染色与流式分析结果显示，与对照组小鼠（）相比，术后 （）时，淋巴细胞（）和 淋巴细胞（）占 淋巴细胞（）的比例均没有明显变化，淋巴细胞与 淋巴细胞的相对比例也没有明显变化（）；术后 （）时，淋巴细胞占 淋巴细胞的比例明显增加（），而 淋巴细胞占 淋巴细胞的比例仍无明显变化（），淋巴细胞与 淋巴细胞的相对比例亦没有明显变化（），见表，表明 淋巴细胞是参与 模型肝脏再生修复过程的重要淋巴细胞亚群。表小鼠 模型中 、淋巴细胞比例变化情况（?）组别鼠数 淋巴细胞（）淋巴细胞（）对照组 术后 术后 值 值 值 值 注：与对照组比较，为术后 ，为术后 ，四、在 肝
13、再生中表达上调流式分析结果显示，与对照组小鼠（）相比，淋巴细胞中 的阳性率在 术后 （）时显著增加（），在术后 （）时显著下降（）（图）；而 淋巴细胞中 阳性率在 术后 时没有明显变化（），术后 时 阳性率显著下降（），见表。表小鼠 模型中 、淋巴细胞 阳性率变化情况（?）组别鼠数 （）（）对照组 术后 术后 值 值 值 值 注：与对照组比较，为术后 ，为术后 ，讨论肝脏再生修复过程是由免疫系统主导的，由多种细胞因子和生长因子调控的复杂过程。本研究利用抑制肝细胞增殖以活化前体细胞的 小鼠肝脏再生模型研究发现 淋巴细胞是参与活化前体细胞的肝脏再生修复的重要淋巴细胞亚群，且其活化标志物 的表达随时
14、间呈先升高再降低的变化趋势。尽管前体细胞主导的肝脏再生修复过程中 淋巴细胞占淋巴细胞的比例没有显著变化，但 是在 汇 管 区纤维 化出现时 阳 性、活 化 ，淋巴细胞比例显著下降。肝脏前体细胞的活化过程伴随着肝脏的炎症细胞浸润，肝脏中淋巴细胞显著增加。缺少淋巴细胞的 （）小鼠经部分肝切除后肝脏损伤加重且 合成能力下降。用 饮食喂饲缺少 淋巴细胞的 （）（）小鼠，与正常对照小鼠相比，前体细胞的活化被显著抑制，表明淋巴细胞参与了肝脏再生修复过程，并具有刺激肝脏 前 体 细 胞 增 殖 的 作 用。本 研 究 发 现，在 小 鼠 模型中 淋巴细胞占 淋巴细胞的比例增加最为显著，提示 淋巴细胞可能是参
15、与肝脏再生调控的重要淋巴细胞亚群。效应 淋巴细胞的活化过程是其增殖和发挥功能的关键，而 是重要的效应 淋巴细胞活化的标志物，。本研究在观察到 小鼠模型中 淋 巴 细 胞 比 例 变 化 的 基 础 上，检 测 了 阳性的 淋巴细胞的比例变化情况，以反映组织浸润的活化 淋巴细胞的变化情况。发现在前体细胞主导的肝脏再生的早期阶段活化的 淋巴细胞比例显著增加，而在汇管区形成纤维化的阶段，活化的 淋巴细胞和 淋巴细胞比例均显著下降，其具体的机制和与前体细胞的关系仍有待进一步研究。综上，小鼠肝再生模型中，伴随着肝脏前体细胞的活化，和 效应淋巴细胞均参与了小鼠的肝脏再生过程，为后续进一步从淋巴细胞的角度探索肝脏前体细胞调控的肝脏再生修复提供了研究思路与线索。利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献 ，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，：，（），：，：，：，：，：，：，：，：（收稿日期：）（本文编辑：钱燕）