1、 ：【收稿日期】；【修回日期】【基金项目】宁夏高等学校一流学科建设（宁夏医科大学国内一流建设学科临床医学）资助项目【作者简介】闫慧，女，内蒙古人，在读硕士研究生，生殖内分泌学专业（通讯作者）剪切变异 致卵巢抵抗综合征的家系分析闫慧，黄蕾，马小红，哈灵侠，赵君利，张倩，闫有圣，刘春莲，（宁夏医科大学总医院生殖医学中心，银川 ；生育力保持教育部重点实验室，银川 ；首都医科大学附属北京妇产医院产前诊断中心，北京 ）【摘要】目的探讨卵巢抵抗综合征（）不孕患者的遗传学病因，为临床遗传咨询及助孕方案提供诊疗依据。方法收集先证者家系临床资料及遗传学检测指标，绘制家系图谱，进行染色体显带核型分析，应用高通量基
2、因测序技术（）进行全外显子组测序；对先证者父母与兄长的变异位点进行 测序验证，并进行生物信息学分析及诊断。结果该女性先证者临床诊断为原发性闭经、；先证者母亲的祖母与父亲的祖父为亲兄妹。全外显子组测序及 测序检测到先证者存在卵泡刺激素受体（）基因经典剪切变异 （纯合型），且该变异为未报道的致病性变异；其兄长该位点突变与先证者一致，其父母均存在 剪切变异 （杂合型）。结论 新发现的剪切变异 的检出，丰富了 基因突变谱，为 的临床治疗和家系成员的遗传咨询提供了参考。【关键词】卵巢抵抗综合征；基因测序；基因；剪切变异【中图分类号】【文献标识码】，【】：（），：，（），：（）（），生殖医学杂志 年月第
3、卷第期 ，（）：，：；（，（）：）卵巢抵抗综合征（，）又称卵巢不敏感综合征（，），即在 岁前患有高促性腺激素低雌激素性闭经，卵巢体积正常，有大量的始基卵泡及初级卵泡，抗苗勒管激素（）值正常或偏高，对促性腺激素不反应，临床症状可表现为原发或继发闭经。该疾 病 需 要 与 卵 巢 功 能 减 退（，）相鉴别。病因不明，可能与促性腺激素受体如卵泡刺激素受体（）缺陷有关，目前已报道多种致病性 变异，一些变异可能导致 。本研究对宁夏医科大学总医院生殖医学中心收治的例确诊为 的年轻原发性闭经患者的临床特征及遗传学资料进行回顾性分析，并对相关文献进行整理和复习，以期为今后的临床实践提供参考。资料与方法一、研
4、究对象先证者来自宁夏医科大学总医院生殖医学中心，在知情同意的前提下采集了患者及父母、兄长的外周静脉血各，并获取了先证者的临床资料。该研究经宁夏医科大学总医院生殖医学中心伦理委员会批准（编号 ）。二、研究方法外周血基因组 提取：采用肘静脉血约，抗凝，用 提取试剂盒（，北京天根生化科技）按照使用说明提取基因组 ，测定 的浓度和纯度，至少约有 的基因组 用于建库。全外显子组测序：使用上海翊圣生物 转座酶法建库 试 剂盒（）进行 片段化、末端修复和接头连接过程。用 试剂盒（公司，美国）进行全外显子组文库捕获文库构建。使用 模式在 （，加拿大）测序平台上进行双端测序。测序数据分析：测序数据经过过滤与评估
5、，过滤掉低质量 （）数据。通过 （）软件将数据与人类参考基因组（，：）对 比。使 用 （）对测序结果与参考基因组进行比对，找出样品中存在的变异信息，包括、等。使用 、等数据库以及 、等 软 件 对 其 进 行 注 释 及 功 能预测。家系成员变异位点的 测序验证：根据目标致病基因突变位点，从 数据库中获取 的基因组 序列，用软件 设计可特异性扩增该基因 突变位点的外显子上下游引物。上游引物：，下 游 引 物：。使 用 仪（杭州 ）对 样本（包含目标基因变异位点的序列）进行扩增，扩增后电泳条带清晰、特异，采用 测序仪（，美国）进行 测序。将所测出的 序列与 数据库（：）中的 序列进行对比分析以发
6、现 基因变异。利用 软件进行分析，并结合文献及 、等多种数据库进行基因变异致病性的判断。变异位点的致病性分析：参照美国医学遗传学和基因组学学会（，）相关指南进行变异致病性分析。结果一、临床资料 基本情况：患者，女（先证者 ），岁，因生殖医学杂志 年月第 卷第期“未避孕未孕年”于 年月就诊于宁夏医科大学总医院生殖医学中心，患者月经初潮 岁，需药物行经，就诊时临床诊断原发性闭经，无结核病及外伤史，无盆腔手术史；经尿促性素粉针剂促排个周期无优势卵泡发育。经临床资料与辅助检查诊断为 。母亲有正常月经史，绝经年龄为 岁；无特殊家族史。先证者母亲的祖母与父亲的祖父为亲兄妹，家系图谱详见图。体格检查：患者身
7、高 ，体重 ，外观发育未见异常，无腋毛，乳房发育不良，阴毛和外生殖器发育正常。辅助检查：超显示单侧多囊卵巢改变，直径 卵泡数大于 个，子宫略小，血型 型，（），染色体核型正常为，；既往甲状腺激素水平正常，肝肾功能未见明显异常，激素水平详见表。图病例家系图谱表患者血清激素水平及参考值激素名称激素水平正常参考区间卵泡刺激素（）卵泡期 黄体生成素（）卵泡期 雌二醇（）卵泡期 催乳素（）睾酮（）抗苗勒管激素（）女性 岁：同型半胱氨酸（）人生长激素（）抑制素（）二、全外显子组测序及变异位点分析结果原始数据经过全外显子组测序，发现先证者存在 经典剪切变异 并为纯合型（图），该变异在 和 均未收录，是尚未报
8、道的新变异。根据 解读指南，该位点为致病性变异。三、测序验证 测序结果表明，先证者存在 剪切变异 ，且兄长与先证者一致，父母（、）存在 剪切变异 并为杂合型（图）。、为四代近亲结婚，根据家系图谱及检测 结 果，推 测 该 新 发 位 点 可 能 源 于 或者。讨论卵泡刺激素（）是由腺垂体分泌的糖蛋白，与 相互作用参与调控卵泡发育和卵巢功能。长约 ，位于染色体 ，是膜受体的 蛋白偶联受体（）超家族成员，其编码区由 个 的外显子和个 的内含子组成，人类 蛋白由 个氨基酸残基组成。具有广泛的胞外结构域，与 结合，连接信号特异性亚域或铰链区，而个跨膜结构域参与受体的激活，并将激活过程传递到由氨基酸序列
9、组成的细胞内环。具有组织特异性，在女性颗粒细胞和男性支持细胞中高表达。生殖医学杂志 年月第 卷第期图 基因 位点测序峰图（图中红色框为变异位点碱基）一、新发现剪切变异 是导致 的关键因素 病因尚不明确，可能是由于 结构异常，导致下游信号通路受阻，雌激素合成障碍，从而影响卵泡发育，而 的转录和翻译受 基因调控，故 基因变异可能导致卵泡发育异常 造 成 。目 前 网 站（：）统计的 突变位点共计 个，其中致病性 个，可能致病 个，良性 个，可能良性 个，其他 个，各种类型包含的位点详见表。等报道 致病性变异 （）和 （）可引起 。本文发现的 新剪切变异 为经典剪切变异，可能导致 长度的蛋白改变，从
10、而导致基因功能缺失。在维持正常生殖功能中发挥至关重要的作用。有文献报道，突变影响患有子宫内膜异位症的不孕症患者的激素表达及辅助生殖技术助孕结局。（）位点携带者的激素敏感性更高，可用于预测辅助生殖技术中卵巢过度刺激综合征（）的发生及活产抱婴率的情况。一项纳入 项研究的 分析发现 多态性可能是亚洲人群 的一种潜在的遗传生物标志物。亦有研究发现 多态性可改变卵巢对外源性 的反应，增加多囊卵巢综合征（）的发生风险，且影响其临床特征和治疗结果 。等 发现 缺乏可能导致卵巢发育不全及某些男性特异性不孕。目前已报道的中国人群 的致病性变异较少，李汶等报道了 （）纯合突变和 （）纯合突变可导致 的发生。生殖医
11、学杂志 年月第 卷第期表 突变位点临床意义 突变位点临床意义 （）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；：可能致病性 （：）；（）；（：）；（）；（：）；（）；（：）；（）；（：）（：）；（）；（：）；（：）；（）；（：）；（）；（：）；（）；（：）；（）；（：）；（）；（：）；（）；（：）；（）；（：）；致病性 （）可能致病性致病性 （：）；（）；（）；：；：；（：）；（：）；良性 （：）；（）；（：）；（）；（）；（）；（）；（）；：；：；（：）；可能良性 （）良性可能良性生殖医学杂志 年月第 卷第期续表 突变位点临床意义 （：）；（）；（）；（）；（）
12、；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（：）；（）；（：）；（：）；（：）；：（？）（？）；（）；（：）；（）；（：）；（）；（：）；（）；（：）；（）；（：）；（：）意义不明确 ；（）；（）；（）；（）；（）；（）；（）致病性存在争议位点二、家系临床资料分析不同突 变 位 点 会 导 致 相 应 的 临 床 表 现 及 症状，我们分析了患者的临床数据及资料。阴式 超下显示患者的单侧卵巢呈现多囊卵巢样改变，表明含有初级或次级卵母细胞期停止发育的卵泡，由于细胞膜上 分子数量
13、减少，卵泡发育成熟后期缺少 的作用，导致卵母细胞成熟障碍。本研究中先证者哥哥与其具有同样的基因型，但遗憾的是，其哥哥因个人原因拒绝提供临床资料及进行进一步检查。先证者的 水平偏高为 ，说明 对于的产生或窦前卵泡的发育不是必 需的。等 研 究发 现 携 带 （）等位基因的女性卵泡数量及卵母细胞较多，女性血清和卵泡液中的 水平 低，但 无 显 著 性 差 异（）。与 其 他 突变导致 活性降低的患者类似，本病例可能初级或次级滤泡膜上的正常 显著降低，但可能在青春期合成了足够的雌激素来刺激部分乳房发育。而因卵泡缺失而导致卵巢早衰的女性 值很低甚至检测不到，这也成为与 鉴别的关键要点。抑制素（）属于转
14、化生长因子（）超家族，血清中高水平的抑制素直接对垂体产生负反馈，导致 下降，因此其可作为预测卵巢反应的更为直接的标记物，是 分泌的 负 调 控 因 子。先 证 者 抑 制 素 水 平 正 常（），符合患者卵巢内大量初级或次级卵母细胞存在的体征。三、患者临床助孕管理策略对于 患者的治疗策略，常规可给予雌孕激素替代治疗维持月经周期；不孕症的处理常给予使用赠卵的建议。随着测序技术的发展，的遗传变异也是不断发展的药物遗传学领域的研究热点，可作为有价值的个体化治疗方案的工具。有研究根据 患者的 突变基因类型、位点突变的功能性以及闭经的类型，分析基因型与表型的关系，可用于推算携带不同 突变位点的患者是 否
15、 适 合 进 行 未 成 熟 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 培 养（）技术。等 对例 患者进行了生殖医学杂志 年月第 卷第期 个 周期，平均获卵数为（）个，培养后有（）个卵母细胞成熟，活产例（），因此认为 是 患者极具价值的助孕方式。等 报道了例携带了个良性变异位点 ，（）和 （）的 患 者，通 过 技 术 分 娩 了 健 康 的 婴 儿。等 对名携带 及 杂合突变的患者，经过次失败的常规 助孕后，行 培养，尽管只有不到（）的卵母细胞发育成熟，但所有成熟卵母细胞均已受精，枚胚胎成功获得活产。结合其他成功的个案报道 ，我们掌握了更多关于 基因型表现型的相关性，为改善家庭遗传咨询提供了更多指导意
16、见，并提高其生活质量，如激素替代治疗促进乳房发育，或行卵母细胞冷冻保存为未来妊娠做准备。鉴于不同的 突变位点导致其相应的氨基酸改变，我们后续将进一步开展 新发现剪切变异 的功能学基础研究，探寻效应子的耦合、与适配蛋白的相互作用以及下游细胞内信号通路机制，以期丰富 的作用机理，为临床治疗提供参考。【参考文献】黄宝怡，许培，刘曼婷，等 卵巢抵抗综合征分级及病因研究中国实用妇科与产科杂志，：，：李汶，何文斌，周立花，等两个基因新突变导致的卵巢抵抗综合征研究 中华医学遗传学杂志，：，：，（），：，：，（），：，：，：，：，：（）（）（），：，：，（）：，：刘春莲，闫有圣，赵君利，等 基因 新变异致常染色体隐性腓骨肌萎缩症的家系分析中华医学遗传学杂志，：，：，：，（），：，？（），：，（），：，：，：（），：，：，：编辑：辛玲生殖医学杂志 年月第 卷第期