1、实验论著 抑制剂对脉络膜黑色素瘤细胞系 细胞增殖的影响及相关机制张益萌，杨瀚毅，宁佳怡，闫小龙，韩 静引用：张益萌，杨瀚毅，宁佳怡，等 抑制剂对脉络膜黑色素瘤细胞系 细胞增殖的影响及相关机制 国际眼科杂志；（）：基金项目：国家自然科学基金资助项目（）；陕西省科技攻关重点研发计划项目（）；唐都医院临床重点研究项目（，）作者单位：（）中国陕西省西安市，西安医学院；（）中国陕西省西安市，空军军医大学第二附属医院眼科；胸外科作者简介：张益萌，在读硕士研究生，研究方向：眼部肿瘤的基础研究。通讯作者：韩静，毕业于空军军医大学，博士研究生，副主任医师，硕士研究生导师，研究方向：眼底病的临床和基础研究 收稿日
2、期：修回日期：摘要目的：阐明组蛋白去乙酰化酶（）抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（）对脉络膜黑色素瘤（）细胞系 细胞增殖的影响并探讨相关机制。方法：使用倒置荧光显微镜观察不同浓度（、）对 细胞形态的影响；法观察 细胞活力的变化；细胞平板克隆形成实验和 染色法观察 对 细胞增殖的影响；同时，检 测 细 胞 增 殖 相 关 蛋 白 、细 胞 周 期 蛋 白 和 以及 和成纤维细胞生长因子（）的表达。结果：与空白对照组比较，光镜下见 可减小 的细胞密度，促进细胞皱缩，且随着 浓度的增加对细胞的抑制作用也增强；法检测结果显示 浓度依赖性抑制 细胞活力，浓度时抑制率达；结果表明 可呈浓度依赖地降低 细 胞 中
3、的 增 殖 蛋 白 、细 胞 周 期 蛋 白 和 的表达；另外，显著降低 染色阳性细胞数和细胞克隆数。更为重要的是，与空白对照组相比，能浓度依赖地降低 和 的表达。结论：能够通过抑制 信号通路抑制 细胞系 细胞的增殖。关键 词：辛 二 酰 苯 胺 异 羟 肟 酸；组 蛋 白 去 乙 酰 化 酶（）；成纤维细胞生长因子；细胞增殖；细胞周期：，：（）；（）；（，），；，：，：（）（）（）：（，）（），（）（）：，：，：；（）；：，（）；（）：引言作为成 人 最 常 见 的 眼 内 肿 瘤，脉 络 膜 黑 色 素 瘤（，）的发病率仅低于视网膜母细胞瘤，是位居眼内肿瘤发病率第二位的恶性肿瘤。病情复杂，
4、恶性程度高，预后极差，易通过血行转移累及肝脏，由于缺乏特异的治疗手段，导致患者的长期生存率较低。目前临床上针对 患者的主要治疗手段包括激光疗法、放射治疗、眼球摘除术等。值得指出的是，出于降低肿瘤细胞转移率和提高患者生存率等方面的考虑，过去对 的治疗常采用眼球摘除术，但并未明显降低 转移率以及患者生存率，并且其作为一种破坏性手术，给患者带来了极大的身心影响。因此，在保留眼球和视力的前提下，探寻有效提高 患者生存率，且无创伤的治疗方法成为了目前亟需解决的问题。组蛋白去乙酰化酶（，）是一种酰胺水解酶，通过调控组蛋白赖氨酸位点的乙酰化和去乙酰化动态平衡参与染色质结构修饰和基因表达。研究发现多种肿瘤细胞
5、中 过度激活，使组蛋白去乙酰化增强，在肿瘤细胞凋亡、增殖和分化等过程中发挥重要作用。因此，成为了研究抗癌药物的重要靶点。抑制剂（，）通过改变组蛋白和非组蛋白的乙酰化状态，诱导肿瘤细胞的凋亡、分化、抑制细胞增殖，从而表现出抗癌活性。作为 的重要代 表 之 一，辛 二 酰 苯 胺 异 羟 肟 酸（，）已经在临床用于治疗皮肤 细胞淋巴瘤。同时，研究表明 在多种肿瘤模型中都能够通过单一或联合用药发挥有效的抗肿瘤作用。成纤维细胞生长因子（，）参与了细胞分化，血管形成，关节软骨的修复，同时已有证据表明，在肿瘤细胞增殖以及促迁移和侵袭能力方面发挥重要作用。本研究旨在探讨 对 细胞系 细胞增殖的影响以及对 的
6、调控作用，进一步阐明 的发病机制，并为 治疗 提供新的实验依据。材料和方法 材料 细胞培养 细胞培养于含 胎牛血清、青、链霉素双抗的 高糖（，）培养基，并置于、恒温培养箱中进行贴壁培养。取对数生长期细胞（细胞增殖至 左右），弃旧培养基，涮洗 遍，加入胰蛋白酶进行消化传代。主要试剂 脉络膜黑色素瘤细胞系 购自湖南丰晖生物科技有限公司；青链霉素购自上海格来赛生命科技有限公司；胎牛血清购自以色列 公司；单克隆抗体、抗体、抗体、抗体 和抗 体 购 自公 司；购 自（，）；试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；增强型细胞活力检测试剂盒（）购自上海七星复泰生物科技有限公司；购自天津市富宇精细化工有限公司。
7、方法 细胞形态学观察 将 细胞接种于培养皿中，随机分为空白对照组、组。观察细胞的贴壁率及细胞形态，当细胞贴壁后按照药物梯度分别处理，利用倒置荧光显微镜观察各培养皿内细胞形态的变化。实验检测细胞活力重悬 细胞，制成密度为 的细胞悬液，孔板中每孔加入细胞悬液（留 个空白组不加细胞，加入同体积的培养基）。细胞置于 恒温细胞培养箱中培养。各孔分别加入 含有不同浓度 的工作液（、），每组设 个复孔，于、细胞培养箱中培养。每孔加入 溶液，、培养箱中孵育，将酶标仪波长设定为，读取各组 值。细胞存活率：将测试孔的 值减去本底的 值（空白组），各重复孔的 值取?。细胞存活率（）（加药细胞 对照细胞）。细胞平板克
8、隆形成实验检测细胞集落形成能力 用胰蛋白酶消化 细胞，低速常温离心收集细胞沉淀，加入培养基吹打混匀，进行细胞计数，调整细胞密度为 ，倍比稀释至 ，将混匀的细胞悬液接种于培养板中。待细胞生长稳定后，加入 处理，空白对照组加入同等量的。后，换用新培养基继续培养细胞。每孔加入 多聚甲醛，固定细胞，去除固定液，加入适量结晶紫染液，然后用水冲洗，放置常温干燥。用 计克隆数，计算克隆形成率。染色法检测细胞增殖取对数生长周期的 细胞，常规操作，消化细胞，制成单细胞悬液，以 个 皿接种于共聚焦皿中。细胞培养过夜或状态稳定后，加入 处理，空白对照组加入同等量的。稀释 原液，每孔加 培养基，培养箱中孵育，弃旧培养
9、基，洗细胞 次。加入 多聚甲醛固定，后弃固定液。每孔加入 ，室温处理。配制 反应液，室温避光孵育。弃反应液，的 洗 次。制备适量 反应液，避光保存。每孔加入 反应液，避光、室温、孵育 后，弃结晶紫染色反应液，每孔加入 的 洗 次。国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 ：电话：电子信箱：细胞蛋白质提取和定量收集培养 的各组 细胞，冰板上操作，倒干培养基，预冷的 洗 遍，用负压吸引器将 吸净。每皿加入约 裂解液，收集细胞裂解液于 离心管中，裂解，在低温高速离心机中 离心，取上清液用 法行蛋白定量，加入 煮沸。检测蛋白表达每孔上样相同蛋白量，置于电泳缓冲液中电泳，电泳结束后，采用恒压 湿转，将蛋白转至
10、 膜，用 脱脂奶粉室温下摇床慢速封闭，将目的条带切下，置于相应一抗中并在下孵育过夜。第 用 缓冲液（）漂洗 膜 次，每次。室温下摇床孵育二抗，采用 化学发光仪进行灰度值检测，用 软件统计各目的蛋白的相对表达。以 肌动蛋白（）作为内参。统计学分析：采用统计软件 进行统计分析，计量资料采用?表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步的两两比较采用 检验；两组间比较采用独立样本 检验。以 为差异具有统计学意义。结果 呈浓度依赖性降低 细胞活力 空白对照组 细胞形态呈梭形，后细胞密度达到（图）。给予不同浓度 药物处理 后，细胞表现出不同程度的形态学改变，表现为细胞皱缩变形，且细胞贴壁不良、生长显著受到
11、抑制，细胞密度逐渐减小，该作用随药物浓度的升高更为明显（图 ）。当药物浓度增加到 时，细胞出现明显死亡（图）。检测结果显示，空白对照组、组、组、组 细胞存活率分别为（）、（）、（）、（）。与空白对照组相比，呈浓度依赖性地抑制 细胞活力（均），药物浓度为 时抑制率达。呈浓度依赖性降低 细胞增殖相关蛋白的表达 可呈浓度依赖性地降低 细胞中增殖相关蛋白 以及细胞周期蛋白 和 的表达（图），与空白对照组（）相比，差异均有统计学意义（）。当 浓度为 时，将、和 的蛋白相对表达量分别降低到（）、（）和（）；当 浓度为 时，、和 的蛋白相对表达量分别降低到（）、（）和（）；而当 浓度为 时，其抑制作用最明显
12、，、和 的蛋白相对表达量分别降低到（）、（）和（）。可降低 细胞 染色和细胞集落形成能力 浓度为 时，可将 染色阳性细胞数比例降低到（），与空白对照组的阳性比例（）相比，差异具有统计学意义（），见图。同时，细胞克隆实验显示，与空白对照组（）相比，组（）细胞克隆数显著减少，差异具有统计学意义（），见图。图 不同浓度 对 细胞形态和活力的影响：空白对照组；：组；：组；：组。图 作用下 中细胞增殖相关蛋白的表达、和 的蛋白表达检测条带。呈浓度依赖性抑制 细胞中 和 表达 结果显示，与空白对照组相比，随着 处理浓度的增加，细胞中 和 蛋白相对表达量显著降低，见图。当 浓度为 时，和 蛋白相对表达量分别
13、下降到（）和（），与空白对照组（）比较差异均具有统计学意义（）；当 浓度为 时，和 蛋白相对表达量分别下降到（）和（），与空白对照组比较差异均具有统计学意义（）；当 浓度为 时，和 蛋白相对表达量分别下降到（）和（），与空白对照组比较差异均具有统计学意义（）。讨论作为成人发病率最高的眼内肿瘤，大多数的 患者被诊断时已经发生远 处转移，其中以 肝转移最为 常见。目前 治疗缺乏特异性强的化疗策略，临床治疗采用的肿瘤手术切除常需联合眼球摘除，创伤大，但却很难有效降低其复发率和转移率，同时对患者的心理和远期生存质量均会产生极大负面影响。因此，对肿瘤的早期发现并对其生长进行阻断是降低肿瘤复发率、转移率，
14、以及提高患者生存率的重要因素。作为经典的 之一，能够在对正常细胞几乎没有毒性作用的浓度下发挥有效的抗肿瘤效应。同时，：图 对 细胞 染色和细胞克隆的影响：染色图；：细胞克隆实验图。图 不同浓度 对 和 蛋白表达量的影响 和 的蛋白表达检测条带。研究证明 能抑制耐药性黑色素瘤生长。另外，已有研究指出 能抑制非小细胞肺癌、细胞系的增殖。恶性肿瘤细胞最主要的危害是具有无限增殖的潜能。而 在多种恶性肿瘤中都表现出了较强的抑制肿瘤生长的作用，然而其在 细胞中是否具有抑制细胞生长的作用并不清楚。本研究发现，对 细胞增殖具有明显的抑制作用，且 浓度介于 ，该药物随着浓度的增加抑制作用也增强，这与其在肺癌肿瘤
15、中的作用相一致。以上结果表明，在 细胞系 细胞中发挥明显的抑制细胞增殖的作用。研究发现，在多种肿瘤中均能起到促进肿瘤细胞增殖的作用，且该作用与上调 信号通路相关。而 在细胞分化和生长，炎症反应，组织修复，血管新生，骨骼生长以及肿瘤细胞增殖中扮演了重要角色。作为 家族抑制剂，抑制 细胞增殖的作用是否与调节 信号有关还不清楚。此外，以往研究表明，在肺癌中 能够通过抑制 降低 和 的表达，发挥抑制细胞增殖的作用。本实验结果也显示，处理的 细胞中 和 的表达显著降低；同时，细胞周期蛋白 的表达也随之降低。更为重要的是，还能够浓度依赖性抑制 和 在 细胞中的表达。以上实验结果表明，能够通过抑制 信号，降
16、低增殖相关蛋白、细胞周期蛋白、的表达。综上所述，本实验探讨了 对 细胞增殖影响的相关机制，证明 能够通过调控 信号抑制 细胞增殖，这为 应用于 患者临床治疗提供了一定的理论依据。需要指出的是本次研究仍有一定的局限性，由于本研究只采用了一种 细胞系，故此次研究结论对其他 细胞系是否可以推广暂不能确定。因此 对其他 细胞系的增殖、代谢、转移等相关生物学功能的影响及机制研究将是我们要进一步探讨的问题。参考文献 裴超，刘静霞 脉络膜黑色素瘤的研究进展 国际眼科杂志；（）：明媚，张劲，罗钢，等 在葡萄膜黑色素瘤中的表达及对细胞增殖和侵袭的影响 国际眼科杂志；（）：，：；（）：，：；（）：，：；（）：，：；：，：；：，：，：；（）：，；（）：，（）；（）：，；（）：，；：，；（）：，：；：，：；（）：国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 ：电话：电子信箱：，；（）：，：；（）：，：；（）：明媚，罗文，高峰 蛋白酶活化受体 在葡萄膜黑色素瘤中的表达及对细胞增殖和侵袭的影响 国际眼科杂志；（）：，；（）：，；（）：，（）；（）：，；：，；（）：，；（）：，；（）：，；（）：，（）：；（）：，；：，；（）