1、DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2021-0790陈娜娜，安雪姣，李讨讨，王慧慧，徐尚荣，满永恒，马友记.BMP6 和 SMAD5 在藏绵羊睾丸组织中的表达和定位.草业科学,2022,39(11):2434-2441.CHENNN,ANXJ,LITT,WANGHH,XUSR,MANYH,MAYJ.ExpressionandlocalizationofBMP6/SMAD5inTibetansheeptestis.PrataculturalScience,2022,39(11):2434-2441.BMP6 和 SMAD5 在藏绵羊睾丸组织中的表达和定位陈娜娜1,2，安
2、雪姣1,2，李讨讨1,2，王慧慧1,2，徐尚荣3，满永恒4，马友记1,2（1.甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州730070；2.甘肃省动物生殖生理及繁殖调控重点实验室,甘肃兰州730070；3.青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁810000；4.永昌县肉用种羊繁育技术推广站，甘肃金昌737200）摘要：骨形态发生蛋白 6(BMP6)能够促进睾丸支持细胞的 DNA 合成和细胞增殖，SMAD 蛋白 5(SMAD5)是其下游信号介质，抑制细胞凋亡，两者在雄性动物生殖过程中起着关键作用。以不同发育阶段(3 月龄、1 岁龄和 3 岁龄)藏绵羊(Ovis aries)为研究对象，运用实时荧光定量 PC
3、R、Westernblot 和免疫组织化学染色法从转录和翻译水平检测了BMP6 和 SMAD5 在藏绵羊睾丸不同发育阶段的表达和分布模式，研究 BMP6/SMAD5 在藏绵羊睾丸发育和精子发生过程中的作用。结果显示：1 岁龄(性成熟期)和 3 岁龄(成年)藏绵羊睾丸中 BMP6mRNA 相对表达量和蛋白表达量均极显著高于 3 月龄(性成熟前)(P0.01)，且两者在性成熟后趋于稳定；随年龄增长，藏绵羊睾丸中 SMAD5mRNA 相对表达量极显著降低(P0.01)，但 SMAD5 蛋白表达量极显著升高(P0.01)。BMP6 和 SMAD5 蛋白在藏绵羊睾丸不同发育阶段的支持细胞和间质细胞中均有
4、表达，推测 BMP6/SMAD5 在精子发生过程中发挥作用。关键词：骨形态发生蛋白 6；SMAD蛋白 5；藏绵羊；睾丸文献标志码：A文章编号：1001-0629(2022)11-2434-08Expression and localization of BMP6/SMAD5 in Tibetan sheep testisCHENNana1,2,ANXuejiao1,2,LITaotao1,2,WANGHuihui1,2,XUShangrong3,MANYongheng4,MAYouji1,2(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GansuAgricult
5、uralUniversity,Lanzhou730070,Gansu,China;2.GansuKeyLaboratoryofAnimalGenerationalPhysiologyandReproductiveRegulation,Lanzhou730070,Gansu,China;3.AcademyofanimalhusbandryandVeterinarySciences,QinghaiUniversity,Xining810000,Qinghai,China;4.YongchangMeatBreedingTechnologyExtensionStation,Jinchang737200
6、,Gansu,China)Abstract:Bonemorphogeneticprotein6(BMP6)isoneofthebonemorphogeneticproteins(BMPs),whichcanpromoteDNAsynthesisandcellproliferationinSertolicells.SMADfamilymember5(SMAD5)isadownstreamsignalingmediatorthatinhibitsapoptosis.BMP6andSMAD5playkeyrolesinmalereproduction.TostudytheroleofBMP6/SMA
7、D5intesticulardevelopmentandspermatogenesisofTibetansheep(Ovis aries),Tibetansheepatdifferentdevelopmentalstages(3months,1year,and3yearsold)wereusedastheresearchobjects.PCR(QuantitativerealtimePCR,qRT-PCR),westernblot,andimmunohistochemicalstainingwereusedtodetecttheexpressionanddistributionpatterns
8、ofBMP6andSMAD5atdifferentdevelopmentalstagesofTibetansheeptestisfromtranscriptionandtranslationlevels.TheresultsshowedthattherelativeexpressionandproteinexpressionofBMP6mRNAinthetestisofTibetansheepat1year(sexualmaturitystage)and3years(adultstage)weresignificantlyhigherthanthoseat3months(pre-sexualm
9、aturity)(P0.01),andbothofthem收稿日期：2022-01-03接受日期：2022-04-05基金项目：青海省科技援青合作专项(2021-QY-202)；国家重点研发计划课题(2021YFD1100502)第一作者：陈娜娜(1997-)，女，甘肃通渭人，在读硕士生，主要从事羊生产研究。E-mail:通信作者：马友记(1976-)，男，山东汶上人，教授，博士，主要从事羊生产研究。E-mail:2434-2441草业科学第39卷第11期11/2022PRATACULTURALSCIENCEVol.39,No.11http:/tendedtobestableaftersexu
10、almaturity.Withincreasingage,therelativeexpressionofSMAD5mRNAinthetestisofTibetan sheep decreased significantly(P 0.01),whereas the expression level of SMAD5 protein increased verysignificantly(P0.01).BothBMP6andSMAD5proteinswereexpressedinsertolicellsandleydigcellsatdifferentdevelopmentalstagesofTi
11、betansheeptestis.ItisspeculatedthattheBMP6/SMAD5pathwayplaysaroleintheprocessofspermatogenesis.Keywords:bonemorphogeneticprotein6;SMADfamilymember5;Tibetansheep;testisCorresponding author:MAYoujiE-mail:转 化 生 长 因 子-(transforminggrowthfactor-,TGF-)超家族包含多种生长因子，对多种细胞类型产生广泛的生物反应1。在哺乳动物中，TGF-相关分子在控制性发育、原始
12、生殖细胞(primitivegermcells,PGCs)生成以及垂体激素的产生、睾丸发育等众多生理过程中发挥着作用2-4。骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMPs)是 TGF-超家族的最大亚家族，属于分泌性生长因子，最初通过在体内诱导异位骨和软骨形成的能力而被分离出来5。胚胎发育过程中多种 BMPs 对小鼠生殖细胞存活和增殖的影响以及出生后生殖细胞和体细胞群的调节已经从体外和体内研究中得到鉴定6-7。SMAD蛋白家族是 TGF-超家族重要细胞因子，它们通过激活相应受体参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程8。哺乳动物中鉴定出的 BMP 家族成员大约有15 个9，
13、研究发现 BMPs 通过与相应受体结合激活SMAD1/5/8 信号通路调控精子发生过程10-11。例如BMP4 通过 SMAD1/5 通路刺激人类支持细胞的分裂12。藏绵羊(Ovis aries)生活在低氧高海拔的环境下，繁殖效率低下。绵羊的繁殖效率与个体的繁殖力直接相关。公羊个体的繁殖力在很大程度受精子发生及成熟的影响。精子发生是一个由睾丸微环境调节的复杂而精细的过程，它由支持细胞、间质细胞、血管、生长因子和细胞因子组成13。作为生精小管内独特的体细胞，支持细胞在调节正常精子发生方面发挥着重要作用。骨形态发生蛋白 6(bonemorphogeneticprotein6,BMP6)是 BMPs
14、 的 一 名 成员，最初是从鼠胚胎 cDNA 文库中分离出来的，并根据其与非洲爪蟾(Xenopus laevis)Vg-1 的同源性被命名为 Vgr-1，随后从骨骼中分离出 Vgr-1 的人和牛同源物并命名为 BMP614-15。在体内新血管形成和成骨细胞分化过程中，BMP6 诱导 SMAD5 的磷酸化和核积累16-17。有研究发现，与其他 BMPs 基因相比，BMP6 在小鼠睾丸中的表达相对较高，这表明 BMP6 可能在睾丸功能中发挥作用18。且 BMP6通过激活 SMAD1/5 通路在生殖细胞的增殖分化中发挥作用19；SMAD5 作为 BMPs 的受体底物来参与相关的信号传导，可以促进未成
15、熟猪支持细胞增殖20。目前，BMPs 家族中关于 BMP6/SMAD5 对成骨细胞的分化调节和肝脏铁调素表达中的作用已有相关研究21-23，但有关睾丸和精子发生过程的报道甚少。本研究通过研究 BMP6 和 SMAD5 在藏绵羊性成熟前后的睾丸组织中的表达情况和分布模式，探究BMP6 和 SMAD5 通路在藏绵羊精子发生过程中的作用，以期为提高藏绵羊繁殖力提供参考依据。1 材料及方法 1.1 材料性成熟前(3 月龄)、性成熟期(1 岁龄)和成年(3 岁龄)的健康雄性藏绵羊各 8 只(甘肃省夏河藏羊养殖合作社提供)，屠宰后采集睾丸组织。所有动物均按照甘肃农业大学动物委员会批准的动物护理和实验程序指
16、南(伦理批准号：GSAU-AEW-2017-0003)进行管理。本研究所用试剂及试剂盒均与陈娜娜等24相同。1.2 方法1.2.1 总 RNA 提取及 cDNA 合成总 RNA 提取及 cDNA 合成方法参考陈娜娜等24。1.2.2 引物设计与合成根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的绵羊 BMP6、SMAD5 和-actin 的 mRNA 序列利用 PrimerPremier6.0 软件设计引物后送至中科羽瞳生物科技有限公司合成(表 1)。第11期陈娜娜等：BMP6 和 SMAD5 在藏绵羊睾丸组织中的表达和定位2435http:/1.2.3 qRT-PCR 及 BMP6、SMAD5mRNA 的相对表达量计算根据 2FastqPCRMasterMixture 试剂盒的操作说明进行 qRT-PCR 扩增。反应体系为20L：上下游引物(10molL1)各0.4L，2TransStartTipGreenqPCRSuperMix10L，模板(cDNA)1L，加DEPC 水至 20L。每个样本设计4个重复。反应条件为：9430s；945s，退火30s，共40 个循环。使用 2-Ct 方