1、HMGA1 在膀胱癌细胞中的作用及其机制研究秦明明，余倩倩，朱亚，叶开，徐雪莹，张德轩，许岩，吴竞(皖南医学院第二附属医院检验科，安徽芜湖241001)摘要:目的探讨高迁移率族蛋白 A1(High Mobility Group Protein A1，HMGA1)对人膀胱移行细胞癌细胞(T24)迁移和化疗耐药的作用及其分子机制。方法采用实时荧光定量 PC(TPC)和免疫蛋白印迹(Western blot)的方法检测 HMGA1在人膀胱上皮永生化细胞(SVHUC1)和人膀胱癌 T24 细胞中的表达;用脂质体将构建好的 HMGA1 siNA 瞬时转染入 T24细胞中，CCK8 法检测沉默 HMGA1
2、 后膀胱癌细胞增殖能力的变化;平板划痕和 Transwell 实验检测沉默 HMGA1 后膀胱癌细胞迁移能力的变化;CCK8 法和流式细胞术检测沉默 HMGA1 后膀胱癌细胞化疗敏感性和存活率的变化;Western blot 检测沉默 HMGA1 后下游相关基因的改变。结果TPC 实验表明，相比于 SVHUC1 细胞中 HMGA1 mNA 的表达水平(098001)，HMGA1 mNA 在人膀胱癌 T24 细胞中的表达上调(355013，P0001);T24 细胞中 HMGA1 蛋白表达量明显高于 SVHUC1 细胞(P005);相比于阴性对照组，沉默 HMGA1 后，膀胱癌细胞的增殖水平明显
3、降低(P0001);且膀胱癌细胞的迁移能力也显著下调(P001);另外，膀胱癌细胞的化疗敏感性和凋亡率也显著增加(P001)。随着化疗药物浓度增加，PI3K 和 AKT 表达不断降低;且在降低 HMGA1 表达水平后，PI3K 和 AKT 表达水平也降低。结论HMGA1 在膀胱癌细胞中表达上调，高水平 HMGA1 可能通过调控 PI3K/AKT 通路促进膀胱癌细胞的转移和化疗耐药，有望为临床膀胱癌的治疗提供新的分子靶点和理论依据。关键词:膀胱癌;T24 细胞;HMGA1;转移;化疗耐药中图分类号:73714文献标识码:A文章编号:10017550(2023)01001605基金项目:皖南医学院
4、校重点项目(WK2022ZF28)作者简介:秦明明(1992)，男，硕士，初级检验技师，研究方向:肿瘤与分子生物学研究。通讯作者:吴竞，副主任技师，研究方向:临床检验和分子标志物。The role and mechanism of HMGA1 in bladder cancer cellsQIN Mingming et al(Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241001，China)Abstract:ObjectiveTo invest
5、igate the effect and molecular mechanism of high mobility group protein A1(HMGA1)on themigration and chemotherapy resistance of human bladder cancer cells(T24)MethodsThe expression of HMGA1 in human bladderepithelial immortalized cells(SVHUC1)and human bladder cancer T24 cells was detected by realti
6、me quantitative PC andWestern blotThe established HMGA1 siNA was transfected into human bladder cancer T24 cells by liposome 3000The proliferationcapacity of bladder cancer cells after HMGA1 silencing was detected by CCK8 methodsChanges of migration in bladder cancer cell af-ter HMGA1 silencing were
7、 detected by plate scratch and Transwell assayCCK8 methods and flow cytometry were used to detect chan-ges in bladder cancer cell survival and chemical sensitivity after silencing HMGA1Finally，Western blot was used to detect changes indownstream related genes after silencing HMGA1esultsCompared with
8、 SVHUC1(098001)，HMGA1 mNA was upregula-ted in human bladder cancer T24 cells(355013，P0000 1)The HMGA1 protein expression in T24 cells was significantly higherthan that in SVHUC1 cells(P005)Compared with the negative control group，HMGA1 silencing decreased the proliferation ca-pacity of bladder cance
9、r cells(P0001)HMGA1 silencing inhibits migration of bladder cancer cells(P001)In addition，thechemotherapy sensitivity and apoptosis rate of bladder cancer cells also increased significantly after HMGA1 silencing(P001)PI3Kand AKT expression decreased as the concentration of chemotherapy drugs increas
10、ed，and PI3K and AKT levels decreased after decrea-sing HMGA1 expression levelsConclusionHMGA1 is upregulated in bladder cancer cellsHigh levels of HMGA1 may promote metas-tasis and chemotherapy resistance of bladder cancer cells by modulating the PI3K/AKT pathway，which is expected to provide new mo-
11、lecular targets and theoretical basis for the treatment of clinical bladder cancerKey words:Bladder cancer;T24 cells;HMGA1;migration;chemotherapy resistance膀胱癌是人类泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，最新的研究表明，全球平均每年新增膀胱癌 40 多万例1。膀胱癌多发于 70 岁左右的老年人2，是影响老龄人口生命健康的疾病之一。由于膀胱癌易复发，易转移。另外，膀胱癌又具有易耐药的生物学特性，部分复发性的肿瘤对放化疗均不敏感，生物治疗612023
12、年 02 月牡丹江医学院学报Feb.2023第 44 卷第 1 期JournalofMuDanJiangMedicalUniversityVol.44No.12023DOI:10.13799/ki.mdjyxyxb.2023.01.021的疗效不确切，总体预后较差。关于肿瘤转移和耐药的分子机制复杂，涉及环境、遗传和突变等多种因素，目前临床上尚没有理想的标志物可以预测和发现膀胱癌患者的预后和化疗耐药。因此，寻找可以指导膀胱癌治疗和预后的新型标志物成为当前的研究热点和重点。HMGA1 作为一组高度保守非组蛋白，能够整合多种转录因子，控制与癌症相关基因的活化和转录3。研究表明，HMGA1 蛋白过表达
13、与胃癌4、结直肠癌5 等恶性肿瘤的发生发展与预后等密切相关。前期实验发现，HMGA1 蛋白在乳腺癌中表达上调，且 let7i 可通过调控 HMGA1 影响膀胱癌细胞的增殖和迁移67。因此，本文通过研究HMGA1 在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌细胞功能的影响，探讨 HMGA1 在膀胱癌的增殖、迁移和化疗耐药中的作用，为膀胱癌的预后和治疗提供新的理论基础。1材料与方法11材料细胞培养基 PMI1640(Hyclone，美国);胎牛血清(GIBCO，美国);HMGA1 siNA、阴性对照和 HMGA1、GAPDH 引物(广州，锐博生物科技有限公司);HMGA1 和 GAPDH 抗体购于 Abcam
14、 公司;mNA 逆转录(Thermo，上海);Trizol 试剂、实时荧光定量 PC 试剂盒(北京，天根生物科技有限公司);Lipofectamine 3000(美国，Invitrogen);增殖和凋亡相关试剂(江苏，碧云天生物技术有限公司)。逆转录和定量测定仪器为美国 Labnet PC 仪和 ABI7500 序列检测系统(Life Technology，美国);Westernblot 测定仪器伯乐生命医学产品(上海)有限公司;流式细胞仪为美国 BD 检测系统。12细胞培养和转染人膀胱移行细胞癌细胞(T24)和人膀胱上皮永生化细胞(SVHUC1)(购自中国科学院上海细胞生物学研究所)，常规复
15、苏，用含 10%胎牛血清、100 u/mL 链霉素和 100 u/mL青霉素的 PMI1640 培养基，置于 37、5%CO2培养箱中培养。HMGA1 siNA 和阴性对照质粒的构建由广州锐博生物科技有限公司合成。将对数生长期且细胞生长状态良好的细胞接种于 6 孔板，24 h后，使用 lipofectamine 3000 按照试剂说明书进行细胞转染。HMGA1 siNA 和阴性对照使用浓度均为 100 nm。以 GAPDH 为内参，比较转染靶向HMGA1 的 NA 干扰组(siHMGA1)及阴性对照组(NC)细胞中的 HMGA1 mNA 水平的表达。13细胞中总 NA 的提取、逆转录和荧光定量
16、PC采用 Trizol 法提取 SVHUC1 细胞、T24 细胞以及转染后的 T24 细胞中的总 NA，用凝胶电泳可视化 rNA 条带分析提取 NA 的完整性。用分光光度法确定提取总 NA 的纯度，并根据试剂说明书的指示，进行 HMGA1 的逆转录和定量测定。HMGA 1 上游引物序列:5 TCCATTCTTCGACATC-CGTCA3，下游引物序列 5 GATCGTGGGCAGAA-CAGGAG3，扩增产物大小为 80 bp;GAPDH 的上游引物序列:5 CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG3，下游引物序列:5 GTGTCGCTGTTGAAGTCAGAG3，扩增产物大小为 99。将 GAPDH 作为内参，采用2CT公式计算 HMGA1 mNA 的相对表达量。14蛋白质提取及 western blotT24 细胞转染HMGA1 siNA 或阴性对照，24 h 后采用改良的放射免疫沉淀法(IPA)裂解缓冲液和苯甲磺酰氟(PMSF)提取细胞总蛋白，使用 BCA 试剂盒测定各蛋白样本的浓度。取 50 g 蛋白经 10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳，常规湿法转膜