1、 中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 Chin J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 489 UPLC-MS/MS 测定人血浆中长春西汀和阿朴长春胺酸的含量及其应用 张林琪，苏文俏，郭建军*，游宇，胡林，周文(湖南恒兴医药科技有限公司，长沙 410205)摘要：目的 建立和验证 UPLC-MS/MS 测定人血浆中长春西汀和阿朴长春胺酸的方法，并用于临床样品检测。方法 以长春西汀-d5、阿朴长春胺酸-d4 为内标，人血浆样品经蛋白沉淀法沉淀处理，色谱柱为 Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm
2、50 mm，1.7 m)，流动相为乙腈-水(含 0.05%甲酸)，梯度洗脱，流速 0.35 mLmin1；电喷雾离子化源正离子监测模式。结果 长春西汀和阿朴长春胺酸线性范围分别为 0.0420.0 ngmL1(r=0.999 7)、0.50250 ngmL1(r=0.999 6)，检测限分别为 0.01，0.10 ngmL1，待测物与内标提取回收率均为 94.81%105.0，基质效应为 94.51%105.0%，RSD均 5%；批内、批间精密度 RSD 均10%。结论 本法特异性强、快速、准确，重复性好，适用于长春西汀临床生物样品检测及生物等效性研究。关键词：长春西汀；阿朴长春胺酸；血药浓度
3、；超高效液相色谱串联质谱法 中图分类号：R917 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2023)04-0489-05 DOI:10.13748/ki.issn1007-7693.2023.04.009 引用本文：张林琪,苏文俏,郭建军,等.UPLC-MS/MS 测定人血浆中长春西汀和阿朴长春胺酸的含量及其应用J.中国现代应用药学,2023,40(4):489-493.Determination of Vinpocetine and Apovincaminic Acid in Human Plasma by UPLC-MS/MS and Its Application ZHANG Li
4、nqi,SU Wenqiao,GUO Jianjun*,YOU Yu,HU Lin,ZHOU Wen(EverPro Medical Co.,Ltd.,Changsha 410205,China)ABSTRACT:OBJECTIVE To establish and validate a UPLC-MS/MS for the determination of vinpocetine and apovincaminic acid in human plasma and apply to the determination of clinical samples.METHODS Vinpoceti
5、ne-d5 and apovincaminic acid-d4 were used as internal standards.Human plasma samples were prepared with acetonitrile to precipitate to protein.The chromatographic column was Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm50 mm,1.7 m),the mobile phase was acetonitrile-water(containing 0.05%formic acid).Gradient e
6、lution with a flow rate of 0.35 mLmin1.Mass spectrometry conditions:Electrospray ionization source(ESI),positive ion detection mode.RESULTS The linear range were 0.0420.0 ngmL1(r=0.999 7)for vinpocetine and 0.50250 ngmL1(r=0.999 6)for apovincaminic acid,and the limit of quantification were 0.01,0.10
7、 ngmL1,respectively.The recoveries of test sample and internal standard were in the range of 94.81%105.0%,and the matrix effect were 94.51%105.0%,RSDs were 5%.The RSDs of intra-and inter-batch precision were all 10%.CONCLUSION The method is specific,rapid,accurate and reproducible.Therefore,it is su
8、itable for the determination of vinpocetine concentration in plasma and can applied to its bioequivalence study.KEYWORDS:vinpocetine;apovincaminic acid;plasma concentration;UPLC-MS/MS 作者简介：张林琪，女，硕士，中级工程师 E-mail:linqi.zhangeverpro- *通信作者：郭建军，男，博士，高级工程师 E-mail:pharma_ 长春西汀(vinpocetine，VP)是从夹竹桃科多年生草本长春
9、花(Catharanthus roseus L.)中开发得到的一种吲哚类生物碱。20 世纪 80 年代，Gedeon Richter 公司最先开发并推出长春西汀，作为钠通道阻滞剂和磷酸二酯酶 1 制剂，其具有强效的血管扩张作用，用于潜在的脑血管疾病的治疗。2007年 11 月，Gedeon Richter 公司的长春西汀片(10 mg，每盒 30 片；每盒 90 片)在中国获进口药品批准，适应证为脑血管疾病，包括脑梗死、脑出血和脑动脉硬化等诱发的各种症状。研究表明，VP在体内经水解反应转变为代谢物阿朴长春胺酸(apovincaminic acid，AVA)，其体内药动学行为也能反映原形药物体内
10、吸收情况1-10。目前有报道采用 LC-MS/MS 同时测定动物基质中 VP 和 AVA1-4，以及分别测定人血浆中 VP或 AVA 的单一成分5-6；Vatsova 等7采用 GC-MS测定人血浆中 VP；Vlase 等8采用 LC-MS 同时测定人血浆中的 VP 和 AVA。但采用 LC-MS/MS 同时测定人血浆中 VP 和 AVA 方法目前还未见报道。本实验采用 UPLC-MS/MS 同时测定人血浆中 VP 490 Chin J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 及其代谢物 A
11、VA 血药浓度，并应用于长春西汀片给药后人体生物等效性研究的血浆样本检测。1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 AB5500 三重四级杆质谱仪(美国 AB Sciex 公司)；Waters ACQUITY UPLC I-CLASS 超高效液相色谱仪(美国 Waters 公司)；MS205DU 型十万分之一天平(瑞士 Mettler Toledo 公司)；5430R 高速冷冻离心机(德国 Eppendorf 公司)；KQ-250E 型超声波清洗仪(昆山市超声仪器)；Medium-S800GUVF 型超纯水仪(上海和泰仪器)；SCDEALL VX-多管道涡旋振荡器安简(北京)科技有限公司。受试制剂：
12、长春西汀片(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：95190603；规格：每片5 mg)。参比制剂：长春西汀片(Gedeon Richter 公司，批号：T72413A；规格：每片 10 mg)。VP 对照 品(中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院，批 号：100947-201804；含量：99.8%)；AVA 对照品(批号：6-JBZ-121-5；纯度：98%)、VP-d5 对照品(批号：7-YKZ-183-3；纯度：98%)、AVA-d4 对照品(批号：9-WEN-42-1；纯度 95%)均购自加拿大 Toronto Research Chemicals 公司；甲醇、乙腈(色谱纯，
13、美国 Merck 公司)；甲酸、二甲亚砜(国药集团化学试剂有限公司)；水为自制超纯水；其余试剂均为分析纯。1.2 检测条件 1.2.1 色谱条件 色谱柱为 Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm50 mm，1.7 m)；流动相 A 为乙腈，流动相 B 为 0.05%甲酸-水，梯度洗脱(03.00 min，55%B，3.013.90 min，5%B，3.904.80 min，55%B)；流速 0.35 mLmin1，柱温为 50，进样量为 10 L。1.2.2 质谱条件 电喷雾离子化源(ESI)；喷雾电压：5 000 V；帘气压力：35 psi；雾化气(GS1)：
14、50 psi；辅助气(GS2)：55 psi；雾化气温度：550；采用正离子方式检测：多重反应监测(MRM)扫描方式；用于定量分析的离子反应分别为VP m/z 351280，VP-d5 m/z 356281，AVA m/z 323280，AVA-d4 m/z 327283，见图 12。1.3 对照品溶液的配制 精密称取 VP 和 AVA 对照品各 10 mg，分别加入甲醇、50%甲醇-水配制成浓度为 500 gmL1的储备液。精密称取 VP-d5 对照品 2 mg，加 图 1 长春西汀(A)、长春西汀-d5(B)的二级碎片质谱图 Fig.1 Secondary debris mass spec
15、trum of vinpocetine(A),vinpocetine-d5(B)图 2 阿朴长春胺酸(A)、阿朴长春胺酸-d4(B)的二级碎片质谱图 Fig.2 Secondary debris mass spectrum of apovincaminic acid(A),apovincaminic acid-d4(B)36%DMSO-甲醇配成浓度为 4 mgmL1的 VP-d5内标储备液。精密称取 AVA-d4 对照品 2 mg，加50%甲醇-水配成浓度为1 mgmL1的AVA-d4内标储备液。以上溶液均于 4 保存。1.4 血浆样品处理 样品于室温环境下融化后，涡旋混匀；取血浆样品 100
16、 L，加入 10 L“1.3”项下内标工作溶液，涡旋混匀，加入 300 L 乙腈，涡旋 5 min；5 500g 离心 10 min；移取 200 L 上清液于 96 孔板中，6 条件下进样 10 L。2 方法学考察 2.1 选择性和特异性考察 使用 6 个单一个体来源的空白基质分别配制成定量下限浓度水平的样品、只含内标的样品以及只含待测物(定量上限浓度水平)的样品，以分别 中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 Chin J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 491 考察内源性物质对待测物和内标的干扰、内标对待测物的干扰及待测物对内标的干扰，结果见图3。VP：待测物及内标干扰 0.00%；AVA：待测物及内标干扰 0.00%。图 3 血浆中长春西汀、阿朴长春胺酸和内标(长春西汀-d5、阿朴长春胺酸-d4)色谱图 A1、A2、B1、B2空白血浆；C1给药后的血浆样品(长春西汀)；C2给药后的血浆样品(长春西汀-d5)；D1给药后的血浆样品(阿朴长春胺酸)；D2给药后的血浆样品(阿朴长春胺酸-d4)。Fig.3 Chr