1、第 33 卷第 1 期2023 年 2 月生物技术Biotechnology33(1):121Feb.,2023 收稿日期:2022-01-26 作者简介:纪海姣(1989-),女,河北省石家庄人,硕士,工程师,研究方向:细胞株筛选与评价,发表中文核刊论文 1 篇,申请发明专利 1项,参与创新药项目获得中国、美国临床试验许可各 1 项,参与完成国家“十二五”重大专项 1 项,E-mail:2272228935 。通讯作者:王鹏银(1983-),男,河南省南阳人,硕士,高级工程师,研究方向:生物制品研究开发和质量控制,负责创新药项目获得中国和美国临床试验许可各 1 项,参与完成国家重大专项 1
2、项,E-mail:wangpengyin 。CHO 细胞高密度流加工艺参数优化纪海姣,于妍,杨金龙,王鹏银(天士力生物医药股份有限公司 上游技术研究室,天津 300400)摘要:目的优化细胞接种密度、培养基、细胞培养温度等参数,提高生产细胞株 PCSK9 蛋白表达滴度。方法试验分四步进行,探讨几款市售培养基优化组合后对 CHO 细胞株蛋白表达滴度的影响;探讨 10.0 106、15.0 106、50.0 106cells/mL 高密度接种流加过程培养基、降温时间等对 CHO 细胞蛋白滴度的影响;在实验数据基础上继续优化,通过更换培养基继续探讨高密度流加工艺的可行性;在反应器对实验数据进行工艺验
3、证。结果CHO细胞 PCSK9 蛋白滴度提升至 2.6 g/L,蛋白滴度成倍增长;15.0 106cells/mL 接种,30.0 106cells/mL 降温至34,继续优化培养基 1#、2#配比,蛋白滴度提升至 4.5 g/L,反应器工艺验证,细胞生长状态稳定,蛋白滴度突破3.8 g/L;继续筛选市售培养基,成功实现80.0 106cells/mL 高密度流加接种,蛋白滴度提升至7.5 g/L。结论 以贝谙基 Eden-B600、Eden-400S 培养基能够实现 CHO 细胞 80.0 106cells/mL 的高密度接种,流加培养 D15 蛋白滴度突破 7.5 g/L。在细胞流加培养过
4、程可以通过培养基成分优化、提高接种细胞密度等改善高密度流加工艺细胞株生长状态,提高目标蛋白产量。以国产培养基替换进口 Sigma EX-CELL Advanced CHO Fed-Batch Medium 极大地降低了生产成本。关键词:重组全人源 PCSK9;高密度流加;CHO 细胞;培养基优化;蛋白滴度中图分类号:Q784 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0018Optimization of parameters for CHO cells high density fed batchJI Hai-jiao,YU Yan,YANG Jin
5、g-long,WANG Peng-yin(Upstream Technology Research Office,Tianshili Biomedical Co.,Ltd,Tianjin 300400,China)Abstract:ObjectiveTo improve the titer of PCSK9 that processed by chinese hamster ovary cells(CHO)through optimiza-tion of cell density,medium,temperature and so on.Method Investigating the eff
6、ect of several commercial medium or combi-nation of several medium to the titer.Investigating the feasibility of high-density flow charging process,by improving the inocu-lation density.Based on the results of the second part experiment,continue screening commercial medium to realize high-den-sity s
7、treaming progress and improve the titer.Verificating the results of the experiment optimization.Result The titer in-creased to 2.6 g/L in medium 4#,two times more than before.The titer increased to 4.5 g/L through high density flow feed-ing process,three to four times more than before,the density of
8、 inoculation is 15.0 106cells/mL.The titer increased to7.5 g/L by changing new commercial medium and higher inoculation density,the density of inoculation as high as 80.0 106cells/mL.ConclusionBy medim of Eden-B600,Eden-400S the density of CHO cells can be 80.0 106cells/mL,and thetiter of D15 achive
9、d 7.5 g/L.The state and titer of cell in high-density fed-batch process can be optimized by optimizing thecomposition of medium and increasing the density of inoculation.The expression of the domestic medium may be higher than theforeign one,and the cost degraded greatly.Keywords:recombinant human P
10、CSK9;high density flow addition process;Chinese hamster ovary cells;medium optimization;protein titer 高密度流加工艺的特点在于缩短了细胞培养时间,能够有效降低细胞生长期的代谢废物对生产阶段细胞的负面影响,提高细胞生产能力1。在生物制药领域,CHO 细胞能够用于多种复杂蛋白的表达,是表达复杂大分子的做理想宿主,当今最畅销的20 种生物药有 11 种以 CHO 细胞作为宿主细胞,市场份额巨大。目前在生物制药领域提高蛋白滴度主要从两方面入手,一方面是分子水平优化,另一方面生 物 技 术2023 年从
11、细胞培养工艺进行优化,培养工艺优化操作简单,成本较低,本文针对稳定表达 PCSK9 单克隆细胞株培养工艺进行优化,以提高蛋白生产效率。国内有关高密度流加工艺在生物发酵方面应用的相关报道较多,其中微生物发酵最为常见,细胞发酵相关报道也不在少数,例如应用微载体技术2实现贴壁细胞高密度流加培养;通过培养条件优化改善细胞株生长状态,实现高密度流加培养报道类文章也较为常见,例如刘学荣等针对 BHK21 悬浮细胞高密度流加工艺的优化,针对培养基成分进行优化,实现了 40.0 106cells/mL 高密度流加培养3,针对这些研究成果,培养基在细胞发酵过程中对细胞生长活率、蛋白表达、蛋白质量等均有较显著的影
12、响。我国作为人口老龄化大国,心血管疾病已经成为威胁我国人口健康的重大疾病之一,未来市场对PCSK9 类健康、高效心血管疾病药物的需求将会进一步加大。作为生物制品类新药,重组全人源抗PCSK9 单抗能特异性结抑制 PCSK9 的功能,进而降低高血脂患者血浆中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平,且与他汀类药物相比无副作用4-5,适用于已接受最大剂量他汀类药物治疗但 LDL-C 仍未达标的高脂血症患者,降低患者动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的发病及死亡风险方面临床疗效显著6,具有广泛的临床前景。笔者实验室筛选平台自主筛选表达抗 PCSK9CHO 工程细胞株 Fed-Batch D15 蛋白
13、滴度仅为1.2 g/L,目前在载体优化基础上蛋白滴度仅能突破2 g/L,改善筛选单克隆抗体 PCSK9 蛋白滴度及质量对提高企业竞争力,降低药品成本等具有重要意义。为此,笔者用国产培养基对实验室自行筛选表达PCSK9 CHO 细胞进行高密度流加工艺开发。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料稳定表达抗 PCSK9 单抗的细胞系,由笔者实验室构建,将构建好的质粒通过电转染的方式,以 300V、一次脉冲将质粒转染入 CHOS 细胞株,此次实验获得转染后细胞株目的蛋白产量为 1.2 g/L。1.1.2 试剂Na2HPO42H2O、NaH2PO42H2O、NaCl、Ace-tonitrile,
14、分析纯,国药集团化学试剂有限公司;甘氨酸,山 东 浩 中 科 技 有 限 公 司;Trypan BlueStain,Gbico。1.1.3 仪器生物安全柜(Thermo,MSC-advantage 1.8)、摇床(Kuhner,ISF4-XL)、二氧化碳恒温箱(SHELLAB,2440-2 型)、比浊仪(IMMAGE 800)、自动细胞计数仪(Inno-Alliance Biotech,Countstar IC100)、生化分析仪(NOVA Plus100)、高效液相色谱系统(Brand Aglient-Modle 200)、2L 生物反应器。1.1.4 培养基表 1 实验所用基础培养基Tab
15、.1 Information of basic medium培养基名称编号pH 值浓度(g/L)流加培养基MaxFAA6.6 6.8180MaxFBB11.0 11.594.5MaxFCC6.6 6.735.95基础培养基F600asD6.8 7.2193.55F600bsE6.8 7.2193.6CHO MaxA1#6.8 7.220CHO MaxC2#7.0 7.220.22CHO MaxD3#7.0 7.221.59Eden-B6009#6.0 6.522.92Eden-400S10#6.0 6.522.8 注:Eden-B600、Eden-400S、F600as、F600bs 为贝谙基
16、 CHO 细胞流加用培养基,其他培养基均为迈邦 CHO 细胞流加用培养基。Note:Eden-B600,Eden-400S,F600as,F600bs are medium ofbioengine for CHO cells fed-batch,others are medium of mediumbank for CHO cells fed-batch.1.2 细胞培养1.2.1 细胞复苏填写细胞支取记录,36.5 温水 1 2 min 内迅速复苏种子细胞,75%乙醇将实验器材及细胞消毒灭菌后擦入无菌生物安全柜,9 mL 基础培养基重悬细胞悬液,800 r/min 离心 5 min 去除 DMSO,离心后细胞重悬于 30 mL 基础培养基,取样计数,活率 90%,活率不正常需重新复苏。1.2.2 细胞扩增培养细胞复苏后 D3 取样计数,按 1.0 1062.0 106cells/mL,10 mL 摇管传代,传代支数根据接种实际需要细胞量计算,传代后取样计数,密度范围0.55 106cells/mL,活率 95%。摇管接种 D3取样计数,密度达到 8.0 10610.0 106cell