1、第 33 卷第 1 期2023 年 2 月生物技术Biotechnology33(1):75Feb.,2023 收稿日期:2021-12-23 作者简介:胥杰(1986-),男,四川省绵阳人,硕士,主治医师,研究方向:支气管哮喘与气道炎性改变,肺癌基因、蛋白表达与诊疗,E-mail:。通讯作者:周贵星(1984-),男,山东省枣庄人,学士,主治医师,研究方向:慢性阻塞性肺疾病的气道重塑、非小细胞肺癌诊疗,E-mail:123841359 。miR-550a-3 靶向 NFIC 表达调控肺癌细胞 HCC827 增殖、迁移和侵袭胥杰,崔继涛,狄红红,周贵星(滕州市中心人民医院呼吸与危重症二科,山东
2、 滕州 277500)摘要:目的 探讨 miR-550a-3 靶向 NFIC 表达调控肺癌细胞 HCC827 增殖、迁移和侵袭作用。方法 检测40 例肺癌患者癌组织和癌旁组织中 miR-550a-3 和 NFIC mRNA 表达,并分析 NFIC 表达与肺癌患者病理特征的相关性。按Lipofectamine 2000 方法分别将 miR-NC、miR-550a-3 mimics 和 miR-550a-3inhibitor 转染到 HCC827 细胞,48h 后检测细胞增殖、迁移和侵袭情况,同时检测细胞中 miR-550a-3 和 NFIC mRNA 表达,并检测细胞中 NFIC、E-cadhe
3、r-in 和 N-cadherin 蛋白表达。结果肺癌组织中 miR-550a-3 表达水平(1.83 0.19)高于癌旁组织(1.00 0.15),NFIC mRNA 表达水平(0.62 0.14)低于癌旁组织(1.00 0.10)(P 0.05);以 miR-550a-3 mRNA 均数为标准,将肺癌患者分为高表达组(22 例)和低表达组(18 例),miR-550a-3 与病理类型和 TNM 分期相关(P 0.05)。转染 miR-550a-3 后,miR-550a-3 mimics 组细胞中 miR-550a-3mRNA、细胞增殖率、迁移细胞数、侵袭细胞数和 N-cadherin 水平
4、较 miR-NC 组增加(P 0.05),NFIC mRNA 及蛋白、E-cadherin 水平较 miR-NC 组降低(P 0.05);miR-550a-3 inhibitor 组细胞中 miR-550a-3 mRNA、细胞增殖率、迁移细胞数、侵袭细胞数和 N-cadherin 水平较 miR-NC 组降低,NFIC mRNA 及蛋白、E-cadherin 水平较 miR-NC 组增加(P 0.05)。结论 通过基因干预技术,降低 miR-550a-3 表达能靶向增加 NFIC mRNA 及蛋白表达,抑制HCC827 增殖、迁移和侵袭。关键词:miR-550a-3;NFIC;肺癌;细胞增殖;
5、细胞迁移;细胞侵袭中图分类号:R734.2 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0012Proliferation,migration and invasion of lung cancer cell HCC827 regulatedby miR-550a-3 targeting NFIC expressionXU Jie,CUI Ji-tao,DI Hong-Hong,ZHOU Gui-xing(Department of Respiratory and Critical Care,Central Peoples Hospital of Ten
6、gzhou City,Tengzhou 277500,China)Abstract:Objective To investigate the effect of miR-550a-3 targeting NFIC expression to regulate the proliferation,mi-gration and invasion of lung cancer cell HCC827.Method The expression of miR-550a-3 and NFIC mRNA in cancer tis-sues and adjacent tissues of 40 lung
7、cancer patients was detected,and the correlation between NFIC expression and pathologicalcharacteristics of lung cancer patients was analyzed.The miR-NC,miR-550a-3 mimics and miR-550a-3inhibitor weretransfected into HCC827 cells respectively according to Lipofectamine 2000 method,and cell proliferat
8、ion,migration and inva-sion were detectd after 48h,and at the same time,miR-550a-3 and NFIC mRNA expression in the cells were detected andNFIC,E-cadherin and N-cadherin protein expression in cells were detcted.Result The expression level of miR-550a-3in lung cancer tissue(1.83 0.19)was higher than t
9、hat in adjacent tissue(1.00 0.15),and the expression level of NFICmRNA(0.62 0.14)was lower than that in adjacent tissue(1.00 0.10)(P 0.05).Based on the mean of miR-550a-3 mRNA,lung cancer patients were divided into high expression group(22 cases)and low expression group(18 cases),miR-550a-3 was corr
10、elated with pathological type and TNM stage(P 0.05).After transfection of miR-550a-3,the miR-550a-3 mRNA(1.63 0.20),the cell prolif-eration rate,the number of migrated cells,the number of invasive cells and the level of N-cadherin in the miR-550a-3mimics group were significantly higher than those in
11、 the miR-NC group,NFIC mRNA and protein,E-cadherin levels werelower than those in the miR-NC group(P 0.05);and miR-550a-3(0.58 0.04),cell proliferation rate,number of生 物 技 术2023 年migrated cells,number of invasive cells and N-cadherin level in miR-550a-3 inhibitor group cells were lower than those in
12、the miR-NC group,NFIC mRNA and protein,E-cadherin levels were higher than those in the miR-NC group(P 5 cm 的癌旁组织作为对照。所有患者术前均未接受化疗或放疗,经病理诊断确诊为肺癌。组织样本置于液氮中,以备后续提取 RNA。本研究通过本院伦理审查委员会批准。1.1.3 试剂人肺癌 HCC827 细胞,上海生命科学研究所;胎牛血清和 RPMI-1640 培养基,浙江天杭生物科技有限公司;Lipofectamine 2000 转染试剂盒,美国 In-vitrogen 公司;miRNA 阴性对照
13、(miRNA negative con-trol,miR-NC)、miR-550a-3 模拟物(miR-550a-3 mimics)、miR-550a-3 抑制物(miR-550a-3inhibitor),上海吉凯生物公司;Trizol,美国 Invitro-gen 公司;mRNA 反转录试剂盒和实时荧光 PCR(RT-PCR)试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司。PCR引物序列由大连 TaKaRa 公司设计并合成:miR-550a-3 上游引物为 5-AGTGCCTGAGGGAGTAAG-3,下游引物为:5-GAACATGTCTGCGTATCTC-3;NFIC 上 游 引 物 为 5-TGGC
14、GGCGATTACTA-CACTTCG-3,下游引物为:5-GGCTGTTGAATG-GTGACTTGTCC-3;U6 上游引物为 5-CCCCTG-GATCTTATCAGGCTC-3,下游引物为:5-GC-CATCTCCCCGGACAAAG-3。四 噻 唑 蓝(Methyltihiazolyl tetrazolium,MTT),美国 Amresco 公司;RIPA裂解液,上海生工生物工程有限公司;NFIC 抗体、E-钙粘蛋白(E-cadherin)抗体、N-钙粘蛋白(N-cadherin)抗体、-actin 抗体和 HRP 标记山羊抗鼠抗体,美国 Santa Cruz 公司。1.1.4 仪器
15、CO2培养箱,美国 Ther-mo Revco 公司;Sunrise型全自动酶标仪,瑞士 Tecan 公司;基质胶和 24 孔Transwell 小室,美国 CORNING 科技有限公司;Real-time PCR 扩增仪和 BD 垂直电泳仪,美国 BD公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养和转染用含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基培养HCC827 细胞,37、5%CO2环境,隔天换液,选择对数生长期细胞进行实验。实验分为 miR-NC 组、miR-550a-3 mimics 组和 miR-550a-3 inhibitor组,按 Lipofectamine 2000 方法分别将
16、miR-NC、miR-550a-3 mimics 和 miR-550a-3inhibitor 转染到HCC827 细胞,48h 后进行相关检测。67 1 期胥杰,等:miR-550a-3 靶向 NFIC 表达调控肺癌细胞 HCC827 增殖、迁移和侵袭1.2.2RT-PCR 检测组织和细胞中 miR-550a-3、NFIC mRNA 表达 分别取组织标本及按 1.2.1 方法干预细胞,加入 Trizol 进行总 RNA 提取,将总 RNA 反转录为 cD-NA,制备 20 L 反应体系,在 Real-time PCR 扩增仪中进行扩增,采用 2-Ct法计算 miR-550a-3 和NFIC mRNA 的相对表达量(以 U6 作为内对照)。1.2.3 MTT 法检测细胞增殖率按照 1.2.1 方法干预细胞后接种于 96 孔板中(3 103/孔),48 h 后加入 MTT(20 L/孔),继续培养 4 h,离心弃上清,加入二甲基亚砜 200 mL,振荡10 min,用酶标仪测定吸光度值(Optical density,OD值),计算细胞增殖率(细胞增殖率=实验组 OD 值/miR-NC 组