1、中 国 医 学 科 学 院 学 报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE16February，2023基金项目:湖北省自然科学基金(2011CDB300)论著circ_0092315 通过调控微小 NA-1256/高迁移率族蛋白 A2 促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖和侵袭柯淑红1，孔彩霞1，徐瑶2，彭聪1武汉市第一医院1内分泌科2病理科，武汉 430030通信作者:彭聪电话:027-85332130，电子邮件:摘要:目的研究 circ_0092315 对甲状腺乳头状癌细胞增殖和侵袭的影响，并探讨其分子机制。方法采用实时荧光定量 PC 方法检测人甲状腺乳头状癌细胞中 ci
2、rc_0092315 的表达水平，CCK-8 法和 Transwell 实验检测 TPC-1 细胞的增殖和侵袭能力，Western blot 检测高迁移率族蛋白 A2(HMGA2)蛋白表达水平。通过生物信息数据库、双荧光素酶报告基因检测、实时荧光定量 PC、蛋白质印迹法探讨 circ_0092315、微小 NA-1256(mi-1256)和 HMGA2 的靶向调控关系。结果circ_0092315 在人甲状腺乳头状癌细胞中呈现高表达(P 均 0.001)。circ_0092315 促进 TPC-1 细胞增殖和侵袭能力(P 均 0.001)。转染 circ_0092315 小干扰 NA 可上调
3、mi-1256 的表达水平(P 0.001)。mi-1256 抑制物上调 HM-GA2 蛋白表达(P 0.001)。结论circ_0092315 在人甲状腺乳头状癌 TPC-1 细胞中呈高表达，通过调控 mi-1256/HM-GA2 轴促进 TPC-1 细胞的增殖和侵袭。关键词:甲状腺乳头状癌;circ_0092315;微小 NA-1256;高迁移率族蛋白 A2中图分类号:581.9文献标志码:A文章编号:1000-503X(2023)01-0016-06DOI:10.3881/j.issn.1000-503X.15026circ_0092315 Promotes Proliferation
4、and Invasion of Papillary Thyroid Carcinoma Cells viaegulating microNA-1256/High Mobility Group A2 axisKE Shuhong1，KONG Caixia1，XU Yao2，PENG Cong11Department of Endocrinology，2Department of Pathology，Wuhan No.1 Hospital，Wuhan 430030，ChinaCorresponding author:PENG CongTel:027-85332130，E-mail:ABSTACT:
5、ObjectiveTo investigate the role and mechanism of circ_0092315 in the proliferation andinvasion of papillary thyroid carcinoma cells.MethodsThe expression of circ_0092315 in papillary thyroid car-cinoma cells was examined by real-time fluorescence quantitative PC.The proliferation and invasion of TP
6、C-1cells was assessed by CCK-8 and Transwell assays.The protein level of high mobility group A2(HMGA2)wasdetermined by Western blotting.The regulatory relationship of circ_ 0092315，microNA-1256(mi-1256)，and HMGA2 was explored by bioinformatics tools，dual-luciferase reporter assay，real-time fluoresce
7、nce quanti-tative PC，and Western blotting.esultscirc_ 0092315 was overexpressed in papillary thyroid carcinomacells(all P 0.001).circ_0092315 promoted the proliferation and invasion of TPC-1 cells(all P 0.001)The transfection of si-circ_0092315 up-regulated the expression of mi-1256(P 0.001)，and mi-
8、1256 inhibitorup-regulated the protein level of HMGA2(P 0.001).Conclusioncirc_0092315 is overexpressed in TPC-1circ_0092315 通过调控微小 NA-1256/高迁移率族蛋白 A2 促进甲状腺乳头状癌细胞的增殖和侵袭Vol.45 No.117cells and it promotes the proliferation and invasion of TPC-1 cells by regulating the mi-1256/HMGA2 axis.Key words:papil
9、lary thyroid carcinoma;circ_0092315;microNA-1256;high mobility group A2Acta Acad Med Sin，2023，45(1):16-21甲状腺癌是目前最常见的内分泌肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势，占内分泌系统恶性肿瘤的 95%1。甲状腺乳头状癌是甲状腺癌临床病理分型之一，也是最常见、分化程度高、恶性度小的甲状腺肿瘤2。尽管对其已有许多研究，但甲状腺乳头状癌的发生发展是一个涉及多因素的复杂生物学过程，目前具体发病机制不清。环状 NA(circular NA，circNA)是一类共价闭合环状的内源性非编码 NA，在正常生理活
10、动以及各种疾病进程中具有重要作用3。研究表明circNA 在肿瘤中表达异常且与肿瘤的发生发展密切相关，但 circNA 在甲状腺癌中的功能尚不清楚。最近研究发现，hsa_ circ_0060060 在甲状腺乳头状癌细胞中表达上调，并通过抑制微小 NA(microNA，mi)-144-3p 增加甲状腺癌细胞的顺铂耐药性4。本研究通过生物信息学方法研究 circ_0092315 对甲状腺癌乳头状癌细胞增殖和侵袭的影响，并探究其潜在的分子机制。材料和方法材料人正常甲状腺细胞 Nthy-ori3-1、人甲状腺乳头状癌细胞 TPC-1、BCPAP、IHH4 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。PMI
11、 1640 培养基、胎牛血清购自美国 Hyclone 公司，TIzol 试剂盒、脂质体转染试剂 LipofectamineTM2000 购自美国 Invitrogen 公司，反转录和实时荧光定量 PC(real-time fluorescencequantitative PC，qT-PC)试剂盒购自日本 Takara 公司，circ_0092315 小干扰 NA(si-circ_0092315)及小干扰 NA 对照(si-对照)、mi-1256 模拟物及模拟物对照、mi-1256 抑制剂及抑制剂对照、空载质粒、过表达人高迁移率族蛋白 A2(high mobility group A2，HM-G
12、A2)质粒购自上海吉玛制药技术有限公司，兔抗人HMGA2 抗体(货号:ab207301)和 GAPDH 抗体购自美国 Abcam 公司，IPA 裂解液和 BCA 蛋白检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司，CCK-8 试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Transwell 小室购自美国Corning 公司，Matrigel 基质胶购自美国 BD 公司。细胞培养及转染人甲状腺乳头状癌 TPC-1、BCPAP、IHH4 细胞在含 10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的PMI 1640 培养基中，37、5%CO2恒温培养箱中培养。取对数生长期的 TPC-1 细胞以 1 105个/孔的密度接种于六孔板中
13、，按照 LipofectamineTM2000 转染试剂盒说明书进行转染。根据处理情况将细胞分为 si-circ_0092315 组和 si-对照组、mi-1256 模拟物组和模拟物对照组、mi-1256 抑制剂组及抑制剂对照组、si-circ_0092315+mi-1256 抑制物组和 si-circ_0092315+抑制物对照组、si-circ_0092315+过表达 HMGA2 组和si-circ_0092315+空载体组。qT-PC 检测采用 Trizol 试剂按说明书提取细胞总 NA，通过反转录试剂盒将总 NA 反转录为 cDNA。在 ABI 7500 定量 PC 仪上完成 qT-P
14、C 扩增，采用2-CT法分别计算目标基因的相对表达量。引物序列:circ_ 0092315 上游引物:5-TGCCAGCATGTAGACCT-CAG-3，下游引物:5-TTGTGAAAATGCCAAGGACA-3;mi-1256 上游引物:5-GGCGCGATTTTAGTTTATC-3，下游引物:5-TTTAATTACCAACCGAATACG-3;GAPDH上游引物:5-GGATTTGGTCGTATTGGGCG-3，下游引物:5-CGGTGCCATGGAATTTGCC-3;U6 上游引物:5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，下游引物:5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。c
15、irc_0092315 基因检测以 GAPDH作为内参，mi-1256 基因检测以 U6 作为内参。细胞增殖实验将转染 si-circ_0092315 的 TPC-1细胞以 2 103个/孔的密度接种于 96 孔板中，分别培养24、48、72 h，每孔加入10 l CCK-8 试剂在37、5%CO2培养箱中孵育 2 h，用酶标仪测定各孔细胞在450 nm 处的光密度(optical density，OD)值。细胞侵袭实验将 10 l Matrigel 基质胶均匀涂在Transwell 小室内面，待基质胶凝固。向24 孔板中加入600 l 含有10%血清的 DMEM 高糖培养基，其内放置Tran
16、swell(8 m)小室。向小室内加入转染 si-circ_0092315 或阴性对照的 TPC-1 细胞(2.5 104个/孔)，置于 37、5%CO2恒温培养箱中培养。24 h 后取出小室，用棉签将上室内面的细胞去掉，4%多聚甲醛固定 30 min，0.5%结晶紫染色液染色 15 min，PBS 清洗 3 次，用棉签擦净膜内面未迁移的细胞和染料，在显微镜下拍照，每个孔随机选 5 个视野拍照，并分别计数后求出平均值进行比较。Western blot 检测按照每 1.0 106个 TPC-1 细中 国 医 学 科 学 院 学 报18February，2023胞加入100 l IPA 蛋白裂解液，混匀后置冰上30 min，4 12 000 g 离心 30 min，取上清液，采用 BCA 法测定蛋白含量。将转有蛋白的 PVDF 膜置于 5%脱脂奶粉室温中振荡封闭 1 h，TBST 缓冲液清洗后，加入兔抗人 HMGA2 抗体(11000)4 孵育过夜，清洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育 2 h，电化学发光法显色，凝胶成像系统扫描分析。双荧光素酶报告基因检测利用 Circular NA