1、病 毒 学 报CHINESE JOURNAL OF VIROLOGYVol.39No.2March 2023第 39 卷 第 2 期 2 0 2 3 年 3 月11 种灭活型样本保存液对病毒核酸保护效果的比较史春丽，黄中强，范晓瑜，肖艳群*，王雪亮*（上海市临床检验中心 分子生物学室，上海 200126）摘要：收集 11种不同厂家的灭活型样本保存液，将甲型流感病毒加入保存液和生理盐水中，在 4、25 和 37 条件下保存 0 h、2 h、4 h、6 h和 24 h后，分别提取各组的病毒核酸，并通过逆转录实时荧光 PCR 检测病毒载量变化，以探究不同样本保存液对病毒核酸保护效果是否存在差异。结果
2、发现不同样本保存液中的病毒载量随保存时间和温度变化存在显著差异。据此可将 11 种灭活型样本保存液的保存效果分为四类：优秀产品：在任一温度（4、25、37）条件下，即使保存 24h时病毒核酸都未发生明显降解，占比 27.2%（3/11）；良好产品：低温（4）和室温（25）情况下核酸未出现降解，但在高温（37）条件下 6 h后保存效果明显下降，占比 27.2%（3/11）；合格产品：低温（4）条件下对病毒核酸具有较好的保护效果，但在室温（25）和高温（37）情况下随保存时间延长其保护效果显著下降，占比 18.1%（2/11）；不合格产品：任一保存条件下对病毒核酸的保护效果都较差，甚至加入病毒后立
3、即导致病毒核酸发生快速降解，占比 27.2%（3/11）。以上结果说明不同厂家样本保存液对病毒核酸的保护效果存在显著差异，可能会导致病毒核酸检测出现假阴性结果。因此，需重点加强对样本保存液的质量监管，以有效保障病毒核酸检测，尤其是新冠核酸检测质量，以更好地做好疫情防控工作。关键词：样本保存液；保护效果；甲型流感病毒；逆转录实时荧光 PCR；新型冠状病毒中图分类号：R331 R373.9 文献标识码：A 文章编号：10008721（2023）02047707DOI：10.13242/ki.bingduxuebao.004244自 2019年底新型冠状病毒肺炎（以下简称新冠肺炎）疫情暴发后，新冠病
4、毒持续突变，逐渐进化为具有更强传染性的奥密克戎变异株1，2，这进一步加速了疫情蔓延，给人们的生活与心理造成了沉重负担3。因此，正确诊新冠肺炎变得尤为关键。目前，新冠病毒核酸检测仍是诊断新冠肺炎的金标准4，其主要包括标本采集、核酸抽提、核酸检测与结果判读等多个流程，其中任何一个环节出现问题都会影响其检测质量5。如先前研究发现不同厂家新冠病毒核酸检测试剂检测性能方面存在较大差异，可能会影响检测结果的准确可靠68。此外，分析前环节的诸多因素，如不规范的样本采集9、不合适的样本保存和运送等，都会对检测结果准确性造成较大影响10。因此，需采取多种措施严格加强新冠核酸检测的质量控制，更好地做好疫情防控工作
5、11。但目前还有一个未能引起足够重视的环节采样管。采样管主要分为灭活型与非灭活型，含胍盐的灭活型样本保存液会更为有效地灭活病毒并保护病毒核酸不被降解，因而在临床被广泛采用11。而随着病毒采样管种类及使用量的激增，相关不良风险事件也随之增多，如样本保存液变色、漏液、管盖损坏等14，都可能影响病毒核酸检测结果。此外，还需尤为关注的一点是样本保存液对病毒核酸的保护能力是否如我们所预期，因其是新冠核酸检测准确可靠的前提条件。为此，本研究以与新冠病毒结构特征相似的流感病毒为替代毒株，选取本地区医疗机构中广泛使用的 11种灭活型样本保存液，观察流感病毒在不同保存温度和时间下其病毒载量的变化情况，以比较不同
6、样本保存液对病毒核酸的保护效果。通过上述评估，一方面为医疗机构选择合适的样本保存液提供参考借鉴，另一方面为相关部门制订相关行业标准提供一定的数据支撑。收稿日期：20220704；接受日期：20221008基金项目：上海市公共卫生体系建设三年行动计划（项目号：GWV2）；上海市“医苑新星”青年医学人才培养资助计划（青年医学人才类临床检验项目）；上海市卫生健康委员会面上项目（项目号：201940264），题目：液态活检中热点突变循环肿瘤 DNA 参考物质的制备与应用；上海市临床检验中心自选课题（项目号：2022ZXKT03），题目：11种灭活型病毒保存液对病毒核酸稳定性及其灭活效果的影响研究。作者
7、简介：史春丽（1995），女，检验技师，从事分子诊断、免疫疾病等相关研究，Email：forever_通讯作者：肖艳群（1964），女，主任技师，从事临床分子检测质量管理，Email：；王雪亮（1981），男，副主任技师，从事临床分子检测质量管理和新技术开发，Email：开放科学（OSID）病 毒 学 报39卷材料与方法1 病毒甲型流感病毒鼠肺适应株（A/PR/8/H1N1）由本科室保存。2 实验试剂与仪器通过前期问卷调查，共选取上海地区医疗机构中广泛使用的 11种不同厂家的一次性样本保存液，分别为杭州医国仁生物科技有限公司、杭州优思达生物技术有限公司、上海孚清生物科技有限公司、上海申启生物科
8、技有限公司、山东威高集团医用高分子制品股份有限公司、江苏康健医疗用品有限公司、上海之江生物科技股份有限公司、潮州凯普生物化学有限公司、江苏美樊生物科技有限公司、江苏默乐生物科技股份有限公司、江苏康为世纪生物科技股份有限公司，对以上厂家进行随机顺序编号为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。甲型流感检测试剂盒（硕世生物科技有限股份公司，江苏）；医用级生理盐水；全自动核酸提取仪Autra 9600 及配套核酸提取试剂（上海之江生物科技股份有限公司，上海）；QuantStudioTM5（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，美国）等。3 甲型流感病毒样本准备和核酸提取将未灭活的甲型流感病毒原液
9、样本加入生理盐水中，以 2倍体积进行倍比稀释，用核酸提取试剂盒和甲型流感病毒检测试剂分别进行流感病毒核酸提取与核酸检测，以确定甲型流感病毒浓度及 Ct 值。而后，根据不同厂家样本保存液的体积，按照 1：108的稀释比例将流感病毒加入到编号为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11共 11种样本保存液和生理盐水对照中，并将其分别置于 4、25 和 37 条件下保存。在 0 h、2 h、4 h、6 h 和 24 h 后，分别从每组中取出 3管，向 96 孔预装板中加入 300L 样本，使用 Autra 9600进行核酸提取。4 逆转录实时荧光 PCR方法（RTPCR）使用甲型流感病毒核酸检
10、测试剂盒（荧光 PCR法）进行流感病毒的核酸检测。严格按照试剂说明书进行操作，其运行程序为：逆转录 50，10min；预变性 95，5min；变性 95，10s 和退火、延伸检测荧光 58，30 s 循环 45 次，在 QuantStudio 5 实时荧光 PCR仪上进行检测。5 核酸检测结果判读根据甲型流感病毒检测试剂盒说明书要求判读结果：FAM 通道检测甲型流感病毒基因，Ct值37且曲线呈 S 型为阳性；Ct 值40 或未检出为阴性，37Ct40 为灰区，需要进行重复检测，如仍在此范围并呈 S型曲线，则判定为阳性。6 数据处理每组实验至少有三个独立重复，本研究将未检出样本的 Ct值定义为
11、40。每组数据用为均数标准差表示，Graphpad prism 8.0进行作图并进行差异显著性分析。结 果1 11种灭活型样本保存液的基本信息11 种不同厂家的样本保存液的主要成份、规格、保存液的颜色、样本保存条件见表 1。2 流感病毒倍比稀释浓度及对应 Ct值将流感病毒用生理盐水 2 倍体积进行倍比稀释，以确定本研究加入样本保存液中的起始病毒浓度，结果见图 1。当流感病毒浓度稀释到 1.56108时，Ct值为 35 左右，可满足本实验中弱阳性病毒样本的需求。因此，本研究以此 Ct值作为稀释流感病毒样本低浓度的起始浓度。此外，为进一步评估编号为 11的厂家样本保存液的保护效果，分别将病毒浓度稀
12、释到 1107和1106分别为中、高浓度的起始浓度。3 不同样本保存液对低浓度病毒核酸的保护效果比较将含有病毒的 11 种保存液和生理盐水对照组分别置于不同保存温度与时间下，通过 RTqPCR检测流感病毒，其 Ct值变化见图 2。生理盐水对照组结果显示，在 4 时随着保存时间的延长其 Ct值逐渐增高。保存 24h 后，相比 4 平均增高 2 个 Ct值，25 和 37 保存条件下未检出 Ct值（Ct=40）。以上结果说明生理盐水对照组在不同温度下，随着保存时间延长核酸逐渐发生降解，其对病毒核酸的保护效果不佳。对于编号为 1、2、3 厂家的样本保存液，其在4、25 和 37 温度下，随着保存时间
13、延长其 Ct值始终在起始 Ct值（0h）上下些微波动，说明这三个厂家的样本保存液对病毒核酸的保护效果优秀。对于编号为 4、5、6厂家的样本保存液，其在 4 和 25 的保存温度下 Ct值未随保存时间延长而升高；但在 37 下保存 24 h 后，其 Ct值明显升高。以上结果表明此三个厂家的样本保存液在低温和室温 4782期史春丽，等.11种灭活型样本保存液对病毒核酸保护效果的比较条件下对病毒核酸具有良好的保护效果，但高温条件下 6 h后其保护效果明显下降。对于编号为 7和 8厂家的样本保存液，在 4 时其 Ct值在初始 Ct值附近波动；在 25 时保存 6 h内其病毒载量较为稳定，但保存 24
14、h时其 Ct值明显升高；而在 37 时其 Ct 值随着保存时间延长 Ct 值逐渐升高，以上结果说明此类厂家的样本保存液在低温情况下对病毒核酸具有较好的保护效果；但在室温和高温情况下，随保存时间延长其保护效果显著下降，总体来讲保护效果一般。对于编号为 9、10、11 厂家的样本保存液，其在4、25 和 37 温度下，随着保存时间的延长其Ct值逐渐升高，直至未能检出。这说明此类厂家的样本保存液对病毒核酸的保护效果较差。尤其是11厂家样本保存液，在低浓度病毒加入 0 h后，其较初始 Ct值即升高 2个 Ct，这表明其不仅未对病毒核酸产生保护作用，反而导致了病毒核酸发生降解。4 11厂家样本保存液对高
15、中浓度病毒核酸的保护效果评价由于 11 厂家样本保存液加入低浓度流感病毒后，初始 Ct值就有部分未检出（Ct=40）。为了进一步验证 11 厂家样本保存液对其它浓度流感病毒核酸的保护效果，我们随后分别向 11厂家样本保存液加入高浓度（1106）和中浓度（1107）的病毒后，在不同条件下保存一定时间后，观察流感病毒 Ct值的变化情况。结果如图 3所示，与生理盐水相比，11厂家样本保存液在加入高中浓度的病毒后，任一时间和温度情况下流感病毒的 Ct 值均大于生理盐水对照组病毒 Ct 值，这都说明 11 厂家样本保存液对病毒核酸具有明显的降解作用。表 111种灭活型样本保存液的主要成份、规格及样本保存
16、条件Table 1Main components，specifications and sample storage conditions of 11 inactivated samplepreservation solutionsOrder1234567891011Main ingredientsH2O，trihydroxyaminomethane（tris），EDTA，sodium dodecyl sarcosinate，guanidine isothiocyanate（or guanidine hydrochloride，urea）Guanidine saltGuanidine saltGuanidine salt、SurfactantGuanidine saltDimethyl sulfoxide，ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate，Tween20，guanidine isothiocyanate，or other viral lysis solutionsGuanidine saltPhenol，guanidine isothi