1、论著 收稿日期 作者简介 孔祥龙（），男，河北昌黎人，河北省胸科医院主管检验师，医学学士，从事临床微生物学研究。通信作者。：种不同肺结核支气管肺泡灌洗液诊断方法的比较研究孔祥龙，孙红梅，邢志伟，徐美丽，翟倩（河北省胸科医院检验科，河北 石家庄 ；河北省胸科医院输血科，河北 石家庄 ）摘要目的 比较不同诊断方法在肺结核患者的支气管肺泡灌洗液（，）中的结核分枝杆菌（，）检出率及利福平耐药率差异，进而评估不同检测技术在肺结核临床诊断中 的应用价值。方 法 回顾 分 析 河 北 省 胸 科 医 院 就 诊 的 肺 结 核 患 者 例，同 一 时 间 分 别 采 用 快速培养系统（培养法）、改良抗酸染色
2、法（染色法）、系统（法）及 荧光探针法（法）对同一患者的 样本进行 及利福平耐药检测，并分析不同诊断方法的结果差异。结果 培养法、染色法、法和 法的 阳性检出率分别为 （）、（）、（）和 （），差异有统计学意义（，）。法 阳性检出率显著高于其他种方法，培养法显著高于染色法及 法，差异有统计学意义（法相对于其他种的值分别为 、和 ，；培养法相对于另外种的 值分别为 、，），而染色法与 法阳性率之间差异无统计学意义（）。培养法、法和 法的利福平耐药检测结果分别为 （）、（）和 （），差异无统计学意义（）。结论种检测方法在肺结核患者 样本中 阳性检出率差异较大，快速培养系统和 系统能够较好地应用于肺
3、结核患者 中 及利福平耐药检测，且 法 阳性检出率更高、检测时间更快速，而利福平耐药检出率差异无统计学意义（）。关键词结核，肺；支气管肺泡灌洗液；染色与标记 ：中图分类号 文献标志码 文章编号 （），（.，；.，）（）（），（）（），（），（）（），第 卷第期 年月河北医科大学学报 ，（），（），（）（），（，），（，），（，），（），（），（）（），（），；结核病及耐多药结核病是全球范围内严重威胁人类健康的传染性疾病，根据世界卫生组织估计，年有 万人死于结核病，全球共发现和通报耐多药或耐利福平结核病患者比 年增加了，全球耐药负担居前三位的国家依次是印度、中国和俄罗斯联邦。结核患者的支气管肺泡
4、灌洗液（，）样本中结核分枝杆菌（，）培养及耐药情况检测仍是无法排痰及无痰肺结核患者诊治过程中的主要依据。前期研究结果显示 系统及 荧光探针法能够更好地应用于肺结核患者 样本中 及利福平耐药情况的检测。但目前国内外关于应用 快速培养系统、改良抗酸染色法、系统及 荧光探针法同时对肺结核患者 进行 及利福平耐药检测，进而分析各种诊断方法对肺结核 诊断价值的报道较少。本文采用种不同检测方法对肺结核患者 中 及其中种利福平耐药检测方法检出情况进行系统比较分析，进一步评估各方法在肺结核临床诊断中的应用价值。资 料 与 方 法一般资料收集 年 月在河北省胸科医院就诊的 例经临床诊断为肺结核患者的 样 本 纳
5、 入 研 究，同 时 分 别 采 用 快速培养系统、改良抗酸染色法、系统及 荧光探针法对同一时间送检样本进行（改良抗酸染色法仅可检测，其他种方法还可进行利福平耐药情况检测）的检测，回顾性分析种不同检测方法对 的阳性检出率及种利福平耐药检测方法的检出差异。检测方法 快速培养系统（培养法）样本转移至 离心管中（若体积超过，则先离心富集后弃上清，再加入 无菌 （）缓冲液充分重悬沉淀），加入等体积 处理液，充分涡旋震荡。室温孵育 。加入 无菌 缓冲液，充分混匀后 离心 ，弃去上清液。加入 重悬沉淀物，取 重悬液接种，接种后的培养管放入 快速培养系统（公司，美国）中培养。将报告为 阳性的培养物参照药敏培
6、养说明进行接种，记录利福平耐药检测结果。改良抗酸染色法（染色法，具体方法参照早期研究的夹层杯离心集菌涂片法）吸取 样本富集后，加入 消化液，充分混匀，离心后，参照改良抗酸染色步骤进行染色、镜检，记录视野内观察到的抗酸杆菌数量。系统（法）若 样本体积小于时，加入等体积的样河 北 医 科 大 学 学 报第 卷第期本处理液，充分混匀即可；当 标本体积大于时，先 离 心 富 集，弃 上 清，再 向 沉 淀 中 加 入样本处理液，并充分涡旋震荡，重悬沉淀。使用新 的 移 液 管 将 混 合 液 加 入 检 测 试 剂 匣（产品，美国），将试剂匣放入检测模块中，启动反应程序。反应结束后，记录 检出结果及利
7、福平耐药结果。荧 光 探 针 法（法）样本中加入等体积的 处理液，充分混匀后，室温孵育 。取处理后样本离心富集，弃上清，沉淀中加入适量无菌生理盐水（无 菌 水）洗 涤 次，弃 去 上 清 液，加 入 提取液，充分混匀后，参照分枝杆菌检测试剂盒（博奥生物，中国）说明书进行检测。将报告为阳性的核酸（值，避免因核酸浓度不足造成“假阴性”结果）参照 耐药基因检测试剂盒（博奥生物，中国）说明书进行利福平耐药基因检测，反应结束后记录利福平耐药结果。统计学方法应用 统计软件分析数据。计数资料比较采用 检验或 精确概率法。以培养法为金标准，计算其他检测方法的敏感度、特异度及准确率等指标。检验对检测结果一致性进
8、行分析，值小于 时为一致性较差，时为一致性一般，时为一致性较好。为差异有统计学意义。结果种不同检测方法 阳性检出率的差异性分析 法 阳 性 检 出 率 最 高，达 到 （）；其次为培养法和 法，阳性检出率分别为 （）和 （）；染 色 法 阳 性 检 出 率 最 低，为 （）。进一步分析显示，种检测方法的 阳性检出率差异有统计学意义（，），见表。进一步对种不同检测方法中两两之间 阳性检出率差异进行分析，结果显示，除染色法与 法检测结果中 阳性检出率差异不大，差异无统计学意义（，），其他检测方法中 阳性检出率均存在较大差异，差异有统计学意义（），见表。表种不同检测方法 阳性检出率差异分析 （，例数
9、，）检测结果培养法染色法 法 法 阳性 （）（）（）（）阴性 （）（）（）（）值 值 表种不同检测方法 阳性检出结果比较 （）检测方法阳性检出（例数，）阴性检出（例数，）值值培养法染色法 （）（）（）（）培养法 法 （）（）（）（）培养法 法 （）（）（）（）染色法 法（）（）（）（）染色法 法（）（）（）（）法 法 （）（）（）（）与培养法 检测结果相比，染色法、法和 法的敏感度差异较大，分别为 （）、（）和 （）；染色法特异度最高为 （），但其他指标 一 般；法 特 异 度 为 （），但准确度和约登指数最高；法的准确度和约登指数最低，见表。表种不同的检测方法与培养法检测 结果的比较 （）染
10、色法培养法（例数）阳性阴性 法培养法（例数）阳性阴性 法培养法（例数）阳性阴性阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 敏感度（）敏感度（）敏感度（）特异度（）特异度（）特异度（）阳性预测值（）阳性预测值（）阳性预测值（）阴性预测值（）阴性预测值（）阴性预测值（）准确度（）准确度（）准确度（）约登指数（）约登指数（）约登指数（）河 北 医 科 大 学 学 报第 卷第期 检验结果显示染色法、法与培养法 检测结果一致性均为一般（染色法 ，法 ，），法与培养法 检测结果一致性较差（，），见表。表种不同检测方法与培养法检测结果的一致性 （，例数）染色法培养法阳性阴性 法培养法阳性阴性 法培养法阳性阴性阳性
11、阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 值 值 值 值 值 值 种不同检测方法利福平耐药检出率的差异性分析培养法药敏试验、法 检测和 法 检测的利福平耐药检测结果分别为 （）、（）和 （），差 异 无 统 计 学 意 义（，），见表。表种不同检测方法 利福平耐药检出率差异分析 （，例数，）检测结果利福平耐药利福平敏感值值培养法药敏试验（）（）法 检测（）（）法 检测（）（）因方法学差异及检测要求不同，同时进行培养法药敏试验和 法 检测的样本总计 例，同时进行培养法药敏试验和 法 检测的样本总计 例，同时进行种方法检测的样本总计 例。以培养法药敏试验的利福平耐药检测结果为金标准，例同时进行培养 法药 敏
12、试 验和 法 检测的样本中 法 检测的利福平耐药检出一致性为 （），整体（利福平真耐药利福平真敏感）一致性为 （）；例同时进行种方法检测的样本中 法 检测的利福平耐药检出一致性为 （），整体（利福平真耐药利福平真敏感）一致性为 （）；例同时进行培养法药敏试验和 法 检测（同时进行种方法检测检测结果一致）的样本中 法 检测的利福平耐药检测的利福平耐药检出一致性为 （），整体（利福平真耐药利福平真敏感）一致性为 （）。为保证研究结果准确可比性，对 例同时采用种方法检测利福平耐药情况的结果进行进一步分析，检验结果显示 法 检测、法 检测与培养法药敏试验利福平检测结果一致性均较好，见表。表种不同分子检
13、测方法与培养法药敏试验利福平耐药检测结果的一致性 （，例数）法 检测培养法药敏试验耐药敏感 法 检测培养法药敏试验耐药敏感耐药 耐药 敏感 敏感 值 值 值 值 讨论结核病仍是当今危害人们健康的重大传染病，从 年发现至今已有百年历史，随着 大流行疫情的影响，结核病疫情形势十分严峻。近年来结核病的研究和诊断渠道的开发，基于肉汤微稀释法的表型药敏试验、基于扩增的靶向测序可直接由痰标本检测耐药结核病，。结核菌病原学检测（包括结核菌培养及药物敏感性试验、结核菌的分子生物学检测等）、分子病理学和全基因组测序检测均为目前肺结核耐药肺结核临床诊断中重要的检测手段。但是在临床诊断中，存在着无痰、少痰及痰菌阴性
14、的肺结核耐药肺结核患者的诊治难度大、各级医疗机构检测水平的差异大等诸多问题，因此，针对目前在 检测中常用的 耐药 检测效能进行评估，可为各级医疗单位的肺结核耐药肺结核的诊治提供理论依据，有利于结核疫情的整体防控。培养阳性仍是目前诊断肺结核的“金标准”，根据报道应用 分枝杆菌快速培养法相比与固体培养基培养法，在检出率 相 当 的 前 提 下 可 将 检 测 时 间 缩 短 一 半（），但 的药敏试验对生物安全性要求河 北 医 科 大 学 学 报第 卷第期高，在多数综合性医疗机构无法有效开展，并且检测耗时长，本研究采用 分枝杆菌快速培养法阳性检出率达到 。改良抗酸染色是目前肺结核诊断最常用的方法，
15、相比于传统的染色法，增加离心集菌的步骤，增加了 的有效检出，操作简单、耗时较短、耗材成本低、对技术人员要求低，缺点是无法进行耐药分析。本研究改良抗酸染色在 中阳性检出率仅为 ，这也与早期研究，结果趋势一致。分子生物学检测，是近年来被 认可并推荐的 及耐药快速诊断方法，我国发布的 肺结核诊断 也将其作为结核重要诊断依据之一。本研究中 荧光探针法阳性检出率为 （），且与染色法 阳性检出率差异无统计学意义，这与徐加誉等 研究报道结果一致。与培养法，法极大地缩短了检测时间，但是检测一致性较差，主要原因是处理的 样本量太少，核酸提取过程中 损失等。同时，操作要求较高，需要强阳性的核酸样本才能够进一步进行
16、耐药基因分析，无疑增加的检测成本和检测时间。推荐的另一项基于分子生物学检测技 术 的 及 利 福 平 耐 药 检 测 方 法 结核分枝杆菌检测系统，是目前结核及耐药结核病快速诊断中的重要的检测方法，尤其是在菌阴性肺结核的 样本检测中具备良好的检测性能。本研究结果显示 法具备非常高的 阳性检出率（），且显著高于培养法、染色法和 法，差异有统计学意义（），对肺结核的临床诊断具备较高的应用价值，可作为一种敏感且省时的诊断方法，用于结核病的微生物学诊断，还可进一步分析利福平耐药基因突变情况 。虽然操作简单，但检测设备及试剂价格昂贵，且无法区分 样本中 的存活状态，很难在基层医院或医疗机构进行推广和应用。研究中发现，以培养结果作为“金标准”，法的检测性能相比于染色法和 法具备更好的敏感度和准确度，一致性也更好；染色法特异度最高为 ，但其他指标一般；法的准确度最低，其他指标一般，且与培养法一致性较差。除染色法无法进行利福平耐药检测外，培养法药敏试验、结 核 分 枝 杆 菌 检 测 系 统 和 耐药基因检测结果均在 左右，差异无统计学意义（），种分子生物学检测方法与传统培养药敏结果一致性较好，这与其