1、分析与检测2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)269DOI:10 13995/j cnki 11 1802/ts 032272引用格式:曾玲，金清 PC-DGGE 技术分析韩式大酱与中式大酱中微生物多样性 J 食品与发酵工业，2023，49(5):269 274ZENG Ling，JIN Qing Analysis of microbial diversity in Korean and Chinese soybean paste by polymerase chain reaction-dena-turing gradient gel electrophoresis J Food
2、 and Fermentation Industries，2023，49(5):269 274PC-DGGE 技术分析韩式大酱与中式大酱中微生物多样性曾玲，金清*(延边大学 农学院，吉林 延吉，133002)摘要微生物在大酱发酵过程中起到至关重要的作用，并与大酱的风味与质量密切相关，因此研究大酱中微生物的多样性有重要意义。该研究选择加工工艺不同的韩式大酱与中式大酱为对象，采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PC-DGGE)技术，通过 PC 扩增、切胶回收、PC
3、测序等分析不同大酱中的微生物多样性。结果表明，大酱中的微生物由于制作工艺的不同存在明显差异。在韩式大酱中，细菌如芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、四联球菌属(Tetrageno-coccus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)，真菌如根毛霉属(hizomucor)、青霉菌属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、外瓶霉属(Exophiala)、曲霉属(Aspergillus)等分布广泛。在中式大酱中，乳酸菌如片球菌属(Pediococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leucanostoc)、肠杆菌属(Entero
4、bacter)，酵母如鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)分布较多。与中式大酱相比，韩式大酱中的真菌种类更丰富。研究结果为进一步探讨传统发酵大酱品质提供了理论依据。关键词PC-DGGE;韩式大酱;中式大酱;微生物多样性第一作者:硕士研究生(金清教授为通信作者，E-mail:jinqing ybu edu cn)基金项目:国家自然科学基金项目(31660452)收稿日期:2022-05-09，改回日期:2022-06-16东北三省素有“大豆之乡”的美誉，其大豆制品通常分为发酵豆制品和非发酵豆制品。传统发酵大豆食品包括豆酱、豆豉、豆浆、酱油、臭豆腐与腐乳等产品1。而东北传
5、统大酱是以大豆为原料，经天然存在的细菌和真菌发酵而成的半固体状调味食品2。在厌氧发酵过程中，厌氧菌快速繁殖，微生物群落的动态变化会对大酱发酵产生一定的影响3，蛋白质在酶的作用下分解为小分子的肽、氨基酸，从而产生独特风味。因此传统发酵大豆制品营养丰富、质地独特、风味醇厚，且在其发酵过程中会发生非酶褐变并产生褐色物质 类黑精，即大豆中富含的蛋白质及其分解产物与还原糖类发生美拉德反应的产物4 5。类黑精作为非消化性高分子物质，除具有食物纤维的生理功能外6，还具有降血压7、抗氧化8、抗肿瘤9 等多种作用生物活性。但传统豆酱发酵工艺为自然发酵，因此其品质因参与发酵的微生物种类而异。基于 16S rNA
6、与 26SrNA 基因的非培养技术能够揭示微生物群落结构，为规避传统微生物群落分析的局限性而开发的各种非培养的方法中，变性梯度凝胶电泳(denaturing gra-dient gel electrophoresis，DGGE)分析是用于快速、经济地研究微生物多样性的最广泛应用的分子方法之一。一般在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，双链 DNA 分子迁移距离由其分子大小与电荷决定，因此同样长度的DNA 片段在胶中的迁移距离相同，从而不能被区分出来，DGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上加入了变性剂梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。因此，本研究以自制的韩式大酱与中式大酱为原料，不
7、进行微生物培养，直接提取样品总 DNA，采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerasechain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PC-DGGE)测定分子指纹图谱，比较生物体所携带基因中的保留性结合序列(conserved region)来确认微生物的变化，分析中式与韩式大酱中的优势菌群，对传统酱类由原材料和加工方法引起的发酵微生物群落变化进行补充，为大酱的标准化生产与质量控制提供理论依据。1材料与方法1 1材料与试剂琼脂糖，上海源叶生物科技有限公司;PBS、TAE食品与发酵工业FOOD AND FEMENTATIO
8、N INDUSTIES2702023 Vol.49 No.5(Total 473)缓冲液，江苏恩莫阿赛生物技术有限公司;DNA 提取试剂盒，广州健仑生物科技有限公司;聚丙烯酰胺凝胶试剂 盒，上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司;SYBGreen，Invitrogen 公司。1 2仪器与设备FA1104 分析天平，上海天平仪器有限公司;Z400K 冷冻离心机，莱比信(中国)科技发展有限公司;SX-700 高压蒸汽灭菌器，日本 TOMY 公司;Bio-ad T100 型 PC 仪、电泳仪、变形梯度电泳仪、Gel-Doc X 凝胶成像仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司;SW-CJ-IFD
9、 超净工作台，上海新苗医疗器械机械制造有限公司。1 3实验方法1 3 1韩式大酱制作工艺流程大豆浸泡沥水蒸煮破碎造型稻草捆绑吊挂自然发酵酱曲酱曲清洗晾晒破碎装坛加盐水(25%，质量分数，下同)自然发酵去除酱油破碎装坛撒食盐白布封口封盖发酵1 3 2中式大酱制作工艺流程大豆浸泡沥水蒸煮破碎造型包装纸包装自然发酵酱曲酱曲清洗晾晒破碎装坛加盐水(25%)自然发酵1 3 3大酱样品 DNA 提取分别称取 10 g 样品与 20 mL PBS(pH 7 0)混匀均质并经 4 层滤布过滤，将滤液于 4 下 400 g 离心 5 min，弃上清液，沉淀用 PBS 重复洗涤3 次后重新加入 3 mL PBS，
10、使用基因组 DNA 提取试剂盒提取其DNA，并在 10 g/L 琼脂糖凝胶上对 DNA 的产量与质量进行电泳分析，将提取 DNA 作为 PC 模板以扩增16S rNA 与 26S rNA 基因10。1 3 4PC 扩增PC 反应体系均为 50 L，体系包括 5 L 10 Buffer(含有 Mg2+)，4 L 25 mmol/L dNTP 混合物，1 U Taq DNA 聚合酶，每种引物50 pmol，DNA 模板用量为 1 L。econditioning PC 用来消除普通 PC过程中的杂合双链 DNA 污染。A:16S rNA 基因 V3 区 PC 扩增条件:引物为341F GC 和 51
11、8。PC 反应程序为 94 预变性4 min 后进入 30 个循环，94 1 min;65 1 min(注:每循环二次后温度降低1);72 1 min，最后72 延伸 10 min。econditioning PC 反应程序:94 预变性 4 min 后进入循环，94 1 min:65 1 min;72 1 min，5 至 10 个循环后 72 延伸10 min。B:26S rNA 基因 PC 扩增条件:引物为 NL1(5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3)与 LS2(5-ATTCCCAAACAACTCGACTC-3)，并且在 NL1的 5端上加入富含 GC 的 DNA 片
12、段(5-CGCCCGC-CGC GCGGCGGGCGGGGCGGGGGC-3)。PC 反 应程序为 94 预变性 4 min 进入 30 个循环，94 1 min;50 1 min;72 1 min，最后 72 延伸10 min。econditioning PC 反应程序:94 预变性4 min 后进入循环，94 1 min;55 1 min;72 1 min，8 个循环后 72 延伸 10 min。1 3 5DGGEPC 产物采用 Bio-ad DCode 检测系统进行DGGE 分析。将 80 g/L 聚丙烯酰胺凝胶置于 TAE 缓冲液中，上样后在100 V 下电泳200 min，并在40%
13、60%的变性梯度下实现了最佳分离，然后用 SYBgreen 染色 45 min，使用 GelDoc X 凝胶成像仪对凝胶进行拍照11。1 3 6DGGE 条带回收、PC 扩增与测序参考郑艳等12的方法，将 DGGE 后的凝胶，置于凝胶成像仪上，选取目标条带切割后放入无菌离心管中，加入 60 L 的灭菌去离子水清洗后加入60 L 的灭菌去离子水并于 4 静置过夜。取储存样品液 2 L 作为 PC 反应模板，进行 PC 扩增并测序。2结果与分析2 1韩式大酱与中式大酱中的细菌多样性分析扩增大酱样品中微生物的 16S rNA 基因，并通过变性梯度凝胶电泳方法调查细菌的群落分布。韩式大酱 PC-DGG
14、E 结果如图 1 所示，并对出现的每个条带进行碱基序列分析，鉴定结果如表 1 所示。韩式大酱中芽孢杆菌属(Bacillus)为优势种，其次为不动杆菌属(Acinetobacter)、四联球菌属(Tetragenococ-cus)和嗜盐单胞菌属(Halomonas)。芽孢杆菌在发酵过程中能分泌多种酶类与抗生素，可协助真菌分解大豆中的蛋白质和淀粉。此外，酱曲在清洗晾晒、破碎装坛后使用盐水浸泡发酵，分离出的四联球菌属和单胞菌属都具有一定的耐盐性，是大豆产品发酵过程中常接种的微生物之一13，可用于酿造酱油、腐乳、黄豆酱等制品中，改善产品风味。分析与检测2023 年第49 卷第5 期(总第473 期)2
15、71图 1韩式大酱中 16S rNA 扩增产物的 DGGE 指纹图谱Fig 1DGGE fingerprints of 16S rNA amplificationproducts in Korean soybean paste表 1韩式大酱中 PC-DGGE 指纹图谱上条带的测序结果Table 1Sequencing results of PC-DGGE fingerprintsin Korean soybean paste编号菌株名称NCBI登陆号相似度C1Tetragenococcus halophilus IAM 1673EU689054100%C2Lactobacillus pobuz
16、ihiiAB32636798%C3Bacillus amyloliquefaciens KFI-GS4-1KJ56086999%C4Tetragenococcus halophilus NBC 12172AP01204699%C5Bacillus polyfermenticus BF1-1GQ86152199%C6Acinetobacter gyllenbergii S-B9DKJ80648499%C7Bacillus amyloliquefaciens AC365KJ38114699%C8Bacillus methylotrophicus SCKB 1354KJ46979999%C9Uncultured bacterium clone Ll142-1O12FJ67175497%C10Tetragenococcus halophilus NBC 12172AP012046100%C11Bacillus amyloliquefaciens KFI-GS4-1KJ56086999%C12Bacillus amyloliquefaciens KFI-GS4-1KJ56086999%C13Ba