1、山东医药2023 年第 63 卷第 8 期cGAS抑制剂对小鼠脑缺血再灌注损伤的干预作用及其机制黄丽丹1，李冰玉1，李亚男1，王苏1，龚平1，21 武汉大学人民医院麻醉科，武汉430060；2 武汉大学口腔医院麻醉科 口腔基础医学省部共建国家重点实验室培育基地和口腔生物医学教育部重点实验室 摘要：目的观察cGAS抑制剂对小鼠脑缺血再灌注损伤的干预作用，并基于自噬调节探讨相关机制。方法雄性C57BL/6小鼠18只，随机分为假手术组、模型组、实验组，每组6只。模型组、实验组采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型，实验组在再灌注前10 min腹腔注射5 mg/kg的cGAS抑制剂RU.521，假手术组分离
2、大脑中动脉但不阻断。再灌注 6 h 后行 HE 染色、Nissl 染色观察脑组织病理变化，Western blotting 法检测脑组织中的 cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白，免疫荧光法检测凋亡细胞并计算凋亡率。结果与假手术组相比，模型组神经元数量减少，细胞固缩，实验组上述改变减轻。模型组脑组织中cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白相对表达量及细胞凋亡率高于假手术组，实验组cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表达及细胞凋亡率低于模型组（P均0.05）。结论cGAS抑制剂预处理可减轻小鼠脑缺血再灌注损伤，其机制可能与调节自噬相关蛋白表达有关。关键词：环状GMP-AMP合酶抑制剂；
3、细胞自噬；脑缺血再灌注损伤doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.08.005 中图分类号：R614 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）08-0021-04Intervention effect and mechanism of cGAS inhibitor on cerebral ischemia reperfusion injury in miceHUANG Lidan1，LI Bingyu，LI Yanan，WANG Su，GONG Ping1 Department of Anesthesiology，Renmin Hospital of
4、 Wuhan University，Wuhan 430060，ChinaAbstract：Objective To investigate the intervention effect of cGAS inhibitor on cerebral ischemia reperfusion injury in mice，and to explore the related mechanism based on autophagy.Methods Eighteen C57BL/6 male mice were randomly divided into three groups：sham grou
5、p，model group，and experimental group，with 6 in each.In the model group and experimental group，the middle cerebral artery occlusion model was prepared by suture method.Mice in the experimental group received intraperitoneal injection of 5 mg/kg cGAS inhibitor RU.521 within 10 min before reperfusion.I
6、n the sham group，the middle cerebral artery was isolated but not blocked.After 6 h of reperfusion，the HE staining and Nissl staining was performed.The protein levels of cGAS，LC3B and Beclin-1 were detected by Western blotting.Apoptosis was detected by immunofluorescence.Results Compared with the sha
7、m group，the model group showed a reduced number of neurons and cellular consolidation.All the changes were alleviated after the administration of cGAS inhibitor.Compared with the sham group，cGAS，LC3B，Beclin-1 and apoptosis in the model group increased.Compared with the model group，cGAS，LC3B，Beclin-1
8、 and apoptosis in the experimental group decreased（all P0.05）.Conclusion cGAS inhibitor can effectively reduce cerebral ischemia reperfusion injury probably by regulating the expression of autophagy-related proteins.Key words：cyclic GMP-AMP synthase inhibitor；autophagy；cerebral ischemia reperfusion
9、injury缺血性脑卒中是我国最常见的卒中类型，具有高发病率、高致残率、高病死率的特点1-3。近年来我国缺血性脑卒中患者数量持续增加且呈现发病年轻化趋势，给家庭和社会带来了沉重的压力4-5。寻求安全有效的治疗方案是缺血性脑卒中相关研究的重点。早期静脉溶栓或机械取栓、及时恢复脑血流基金项目：国家自然科学基金项目（82102295）。第一作者简介：黄丽丹（1990-），女，硕士研究生，主管护师，主要研究方向为围手术期重要脏器的保护机制。E-mail：通信作者简介：龚平（1985-），女，硕士研究生，主治医师，主要研究方向为再灌注损伤的相关机制。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）2
10、1山东医药2023 年第 63 卷第 8 期是目前治疗缺血性脑卒中的首选方案，但在脑组织恢复血供后常会出现损伤进一步加重的现象，即脑缺血再灌注损伤（CIRI）6-7。再灌注损伤是十分复杂的级联反应，涉及多种因素与机制8。新近研究发现，环状GMP-AMP合酶（cGAS）天然免疫信号通路参与再灌注损伤的激活，同时有研究表明 cGAS介导的天然免疫通路与细胞自噬密切相关9-11。对于cGAS天然免疫信号通路是否能通过调控细胞自噬进而参与脑缺血再灌注损伤，以及抑制 cGAS激活对缺血再灌注损伤的干预作用，目前尚不明确。2021年9月2022年6月，本研究观察了cGAS抑制剂RU.521对小鼠CIRI的
11、干预作用，并基于自噬相关蛋白表达调节探讨相关机制。现报告如下。1 材料与方法 1.1实验动物与主要材料健康雄性C57BL/6小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，采用随机数字表法分为假手术组、模型组、实验组，每组6 只。cGAS 抑制剂 RU.521 购自美国 MedChemexpress公司，HE染色试剂和Nissl染色试剂购自武汉赛维尔生物科技有限公司，cGAS抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，LC3B 购自美国 CST 公司，Beclin-1购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，TUNEL试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司。1.2模型制作及cGAS抑制剂用法模型组、实验组采用线栓法制备大
12、脑中动脉栓塞模型。参照课题组前期研究 12 中的方法，小鼠室温下称重麻醉后仰卧位固定，剪除术野毛发，碘伏消毒皮肤，颈部正中切口，显微镜下钝性分离左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，避免损伤迷走神经，分别结扎颈总动脉近心端和颈外动脉起始处，在颈总动脉上系一活结，随后在颈总动脉上剪一小缺口，将线栓沿颈总动脉插入颈内动脉，自颈总动脉分叉处进线9 10 mm。缺血1 h后将线栓取出进行再灌注。假手术组分离大脑中动脉但不阻断。实验组于再灌注前10 min腹腔注射5 mg/kg的cGAS抑制剂RU.521。1.3脑组织损伤情况评估于再灌注6 h后处死小鼠，分离颅骨取出脑组织，石蜡包埋后制备切片。部分切片依次
13、使用二甲苯、梯度乙醇脱蜡水化，苏木素染色并冲洗，1%盐酸乙醇分色，0.6%氨水处理，HE染色观察胞核和胞质染色情况；部分切片于载玻片上摊平，置于烤片机烤片，依次使用氯仿、梯度乙醇浸片。蒸馏水洗涤后室温下焦油紫进行Nissl染色观察尼氏体。1.4脑组织细胞凋亡率检测取适量脑组织用多聚甲醛固定，制备石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，水浴锅加热 0.01 mol/L 柠檬酸钠缓冲液至95，放入切片加热，待缓冲液冷却后用PBS清洗，滴加一抗黑暗处孵育过夜；次日37 复温，PBS清洗，滴加二抗，室温避光孵育后加入DAPI，黑暗中继续孵育；采用抗荧光猝灭密封试剂进行密封；显微镜下拍照，观察并计算凋亡细胞
14、数，以凋亡细胞数除细胞总数计算凋亡率。1.5脑组织中cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白检测取适量组织加入RIPA后冰上裂解、离心、提取总蛋白，计算各样品蛋白浓度。根据蛋白分子大小制备分离胶及浓缩胶，上样后以 90 V 电泳至 Marker 分出条带，转至120 V直至溴酚蓝跑至分离胶底部终止电泳。将PVDF膜置入转移槽，加入预冷的电转液，根据蛋白分子大小设定转移时间进行电转。加入cGAS（1 500）、LC3B（1 1 000）、Beclin-1（1 500）一抗4 摇床孵育过夜。次日TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，ECL显影，扫描后分析蛋白条带灰度值。1.6统计学方法采
15、用Graph Pad Prism9.0软件。正态分布的计量资料以-x s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Turkey检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1各组小鼠脑组织损伤情况比较假手术组细胞未见病理改变；与假手术组相比，模型组病理学形态异常，主要表现为神经元形态不规则，固缩或消失，尼氏小体稀少或消失；与模型组相比，实验组神经元形态相对规则，大部分细胞膜较完整，胞核较清晰，尼氏小体数量较多。见图1。2.2各组小鼠脑组织细胞凋亡率比较模型组小鼠脑组织细胞凋亡率高于假手术组，实验组细胞凋亡率低于模型组（P均0.05）。见表1。2.3各组小鼠脑组织中cGAS、LC3B、B
16、eclin-1蛋白表达比较模型组小鼠脑组织中cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表达高于假手术组，实验组cGAS、LC3B、Beclin-1蛋白表达低于模型组（P均0.05）。见表1。假手术组模型组实验组注：A为HE染色；B为Nissl染色。图1各组小鼠脑组织病理变化22山东医药2023 年第 63 卷第 8 期3 讨论 缺血性脑卒中是我国人口致死、致残的主要因素，给家庭和社会带来了沉重的经济负担13-14。目前缺血性脑卒中的治疗手段以溶栓或取栓为主，有助于恢复脑组织的有效灌注，但治疗后常会出现更严重的并发症即CIRI15。CIRI是十分复杂的级联反应，涉及氧化应激、炎症反应、细胞自噬、兴奋性毒性、钙超载、线粒体功能受损等多种机制，而这些因素彼此关联、相互作用，最终导致缺血区神经元的坏死和功能障碍16-17。因此，积极寻求减轻CIRI的方案已成为临床关注的热点。cGAS通路作为经典的天然免疫信号通路，可通过识别病原相关分子模式从而抵御病原体入侵，亦可利用损伤相关分子模式对机体进行监控，是机体抵御病原体入侵的关键性自我监控防御系统18-19。近期cGAS通路在非免疫生理过程中的作用亦