1、HPLC 同时测定苍耳子中 4 个化学成分的含量张文如#，朱彦军#，巴亚辉，张宝骞，吴晨熙，郭建行，周洪雷*(山东中医药大学，山东济南 250355)摘要:目的建立高效液相色谱测定苍耳子中绿原酸、咖啡酸、噻嗪二酮、咖啡酰基-噻嗪二酮苷 4 种化学成分的方法。方法采用 KromasilC18色谱柱(5 m，4.6 250 mm)，以甲醇-0.1%磷酸水溶液(2080;3565;v/v)为流动相，梯度洗脱，流速 1 mLmin1，柱温箱温度 35，检测波长 320nm;进样体积 20 L。结果4 种成分在各自的线性范围内线性关系良好，加样回收率在 97.24 100.40 之间，SD 分别为 0.
2、69%、1.47%、0.99%、1.56%。绿原酸、咖啡酸、噻嗪二酮、咖啡酰基-噻嗪二酮苷的标准曲线方程分别为 Y=47575x+1077、Y=78601x+26.699、Y=9711.7x+13.411、Y=22052x+2.3687，在 0.100 0.625 mgmL1、0.02 0.100 mgmL1、0.020 0.080 mgmL1、0.020 0.070 mgmL1浓度范围内线性关系良好，平均加样回收率 SD 分别为 0.69%、1.47%、0.99%、1.56%。结论建立的含量测定分析方法重复性好，稳定性强，灵敏度高，可用于苍耳子中 4 种成分的含量测定，为质量控制奠定基础。关
3、键词:苍耳子;化学成分;含量测定;HPLC中图分类号:927文献标识码:A文章编号:1006-3765(2023)-02-0066-03注:#张文如，朱彦军为共同第一作者。通讯作者:周洪雷。Simultaneous Determination of Four Chemical Constituents in Fructusxanthii by HPLCZHANG Wen-ru#，ZHU Yan-jun#，BA Ya-hui，ZHANG Bao-qian，WU Chen-xi，GUO Jian-hang，ZHOU Hong-lei*(Shandong University of Traditio
4、n Chinese Medicine，Jinan 250355，China)ABSTACT:OBJECTIVEA method for the determination of chlorogenic acid，caffeic acid，thiazidedione，andcaffeoyl-thiazidedione glycosides in Fructus xanthii by HPLC was established.METHODSKromasil C18column(5m，4.6 250 mm)，mobile phase methanol-0.1%phosphoric acid aque
5、ous solution(2080;3565;v/v)，flow rate1 mLmin1，detection wavelength 320 nm，column oven temperature 35，injection volume 20 L.ESULTSThe linear relationship of the 4 constituents was good in their respective linear range.The recoveries were 97.24 100.40%and the SD were 0.69%，1.47%，0.99%and 1.56%respecti
6、vely.The standard curve equations ofchlorogenic acid，caffeic acid，buprofezin and caffeoyl-buprofezin were Y=47575x+1077，Y=78601x+26.699，Y=9711.7x+13.411，Y=22052x+2.3687，respectively.The linear relationship was good in the concentration rangeof 0.100 0.625 mgmL1，0.02 0.100 mgmL1，0.020 0.080 mgmL1，0.0
7、20 0.070 mgmL1.Theaverage recovery SD were 0.69%，1.47%，0.99%，1.56%.CONCLUSIONThe method was repeatable，stableand sensitive，and could be used for the determination of the 4 constituents in Fructus xanthii.KEY WODS:Fructus xanthii;constituents;determination;HPLC苍耳子(Fructus xanthii)是菊科植物苍耳(Xanthium sib
8、iri-cum Patr.)干燥成熟果实，味辛，性平、苦温，归肺经，有通鼻窍、祛风、除湿、散风止痛等功效，主要用于风寒头痛、鼻渊、风疹、湿疹等症1，2。苍耳子含有酚酸、黄酮、噻嗪、木脂素、倍半萜内酯等多种成分3-4，6。现代药理研究表明，该药有降血糖、镇咳、降压、抗炎、抑菌等作用5。苍耳子中以绿原酸为主的酚酸类成分被认为是苍耳子中的主要镇痛抗炎活性成分7，咖啡酸具有抗癌、抗氧化及抗炎活性8，噻嗪二酮类也具有较强的抗炎镇痛的生物活性9。根据 2020 年版中国药典对苍 耳 子 含 量 测 定 规 定，按 干 燥 品 计 算，含 绿 原 酸(C16H18O3)不得少于 0.25%。目前该药材质量评
9、价的文献报道主要包括高效液相色谱法测定酚酸类(绿原酸、异绿原酸等)和水溶性苷类化合物成分(苍术苷及羧基苍术苷)的含量，没有关于苍耳子中咖啡酸、噻嗪二酮、咖啡酰基-噻嗪二酮苷含量测定的报道。本文建立了 HPLC 测定苍耳子中绿原酸、咖啡酸、噻嗪二酮、咖啡酰基-噻嗪二酮苷的含量方法，为苍耳子的质量控制提供参考。1仪器与材料1.1仪器Agilent1260 型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);XS105 电子天平(瑞士布鲁克公司);旋转真空蒸发仪(瑞士布鲁克公司)等。1.2药品和试剂苍耳子购自河南省南阳市桐柏县毛集镇，经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定为菊科苍耳属植物苍耳的成熟果实苍耳子(Xanth
10、ii Fructus)。对照 品 绿 原 酸(110753-201817)、咖 啡 酸(110885-66海峡药学2023 年第 35 卷 第 2 期201703)购于中国食品药品检定研究院;噻嗪二酮(B 21087-5)购于上海源叶生物科技有限公司;咖啡酰基-噻嗪二酮苷为实验室自提，HPLC 测定纯度为 98%。试剂:蒸馏水、甲醇(色谱纯);其余试剂均为国产分析纯。2方法2.1色谱条件流动相:甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(C);检测波长 360 nm;流速 1 mLmin1;柱温 35;进样体积 20L;梯度洗脱，0 10 min，20%A;10 25 min，35%A;25 42min，
11、35%A 70%A。按照以上条件，4 种对照品绿原酸、咖啡酸、噻嗪二酮、咖啡酰基-噻嗪二酮苷的色谱图见图 1、图 2、图 3、图 4，供试品色谱图见图 5。图 1绿原酸对照品图 2咖啡酸对照品图 3噻嗪二酮对照品2.2对照品溶液的制备精密称定绿原酸对照品 25 mg，置25 mL 容量瓶中，以去离子水溶解完全，定容至刻度线。精密称定咖啡酸、噻嗪二酮、咖啡酰基-噻嗪二酮苷对照品各 10mg，分别置 10 mL 容量瓶，蒸馏水溶解，定容至刻度。4 种对照品溶液浓度分别为 1.0012 mgmL1、1.0020 mgmL1、1.0020 mgmL1、1.0010 mgmL1。图 4咖啡酰基-噻嗪二酮
12、苷对照品图 5供试品色谱图注:1:绿原酸;2:咖啡酸;3:噻嗪二酮;4:咖啡酰基-噻嗪二酮苷2.3供试品溶液的制备苍耳子药材，粉碎，过 60 目筛，精密称定 5.0 g，置 250 mL 具塞锥形瓶，加甲醇 100 mL，称重。超声(300 W，40 kHz)40 min，放冷，甲醇补足失重，提取液抽滤，减压浓缩，浓缩液转移至 10 mL 容量瓶，甲醇定容，0.22m 滤膜过滤，即得供试品溶液。2.4线性关系考察精密量取 2.2 项下绿原酸对照品溶液1.00、1.50、2.00、2.50、3.75、5.00、6.25 mL，分别置 10 mL 容量瓶，蒸馏水定容;精密吸取 2.2 项下咖啡酸对
13、照品溶液0.500、0.625、0.750、1.000、1.250、1.875、2.500 mL，分别置于10 mL 容量瓶，蒸馏水定容;精密吸取噻嗪二酮对照品溶液0.50、0.75、1.00、1.25、1.5、1.75、2.00 mL 分别置于 10 mL 容量瓶，蒸馏水定容;精密量取 2.2 项下咖啡酰基-噻嗪二酮苷对照品溶液 0.500、0.625、0.750、1.000、1.250、1.500、1.750mL 各置 10 mL 容量瓶，蒸馏水定容。以上溶液依照 2.1 项下色谱条件，进样测定，以各个对照品溶液浓度(mgmL1)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制各个对照品标准曲线图，计算回归方
14、程:绿原酸 Y=47575x+1077(r=0.9995)、咖啡酸 Y=78601x+26.699(r=0.9999)、噻嗪二酮 Y=9711.7x+13.411(r=0.9995)、咖啡酰基-噻嗪二酮苷 Y=22052x+2.3687(r=0.9999)。结果表明绿原酸在浓度为 0.100 0.625 mgmL1、咖啡酸在 0.02 0.10 mgmL1、噻嗪二酮在 0.02 0.08 mgmL1、咖啡酰基-噻嗪二酮苷在 0.02 0.07 mgmL1之间线性关系良好。2.5精密度分别取 2.4 项下绿原酸、咖啡酸、噻嗪二酮、咖啡酰基-噻嗪二酮苷对照品溶液，按照 2.1 项下色谱条件，连续测
15、定 6 次，计算 SD。结果表明各对照品 SD 分别为0.77%(绿原酸)、0.91%(咖啡酸)、0.97%(噻嗪二酮)、76Strait Pharmaceutical Journal Vol.35 No.2 20230.94%(咖啡酰基-噻嗪二酮苷)，表明密度良好。2.6稳定性取苍耳子供试品溶液按照 2.1 项下色谱条件分别在 0、2、4、8、12、24 h 时进行含量测定，供试品中各对照品峰面积 SD 分别为为 0.96%(绿原酸)、0.84%(咖啡酸酸)、0.85%(噻嗪二酮)、0.86%(咖啡酰基-噻嗪二酮苷)，表明苍耳子供试品在 24 h 内基本稳定。2.7重复性取同一批次苍耳子，按
16、照 2.3 项下方法平行制备 6 份供试品溶液，供试品溶液按照 2.1 项下色谱条件进行测定，结果表明 4 个对照品峰的峰面积及保留时间的 SD 值分别在 1.47%1.91%、0.11%0.16%之间，表明该实验方法重复性良好。2.8检测限与定量限取 2.2 下各对照品溶液，以去离子水进行逐级稀释，按照 2.1 项下色谱条件测试，以 S/N=3 求得各对照品的检测限分别为;7.5 ng(绿原酸)、5.0 ng(咖啡酸)、6.5 ng(噻嗪二酮)、5.5 ng(咖啡酰基-噻嗪二酮苷);S/N=10 求得各对照品定量限分别为 24.0 ng(绿原酸)、15.0 ng(咖啡酸)、20.8 ng(噻嗪二酮)、17.6ng(咖啡酰基-噻嗪二酮苷)。表 14 种成分加样回收率测定结果(n=6)称样量(mg)含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均值(%)SD(%)绿原酸2513.87 2.33792.3404.675599.9099.870.692537.34 2.35972.3404.689799.572592.10 2.41062.3404.7703 100.842549.3