1、0 8 7CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变2023 年 3 月第 35 卷第 2 期收稿日期：2023-02-10；修订日期：2023-02-24基金项目：国家重点研发计划项目(2021YFC2501000)；国家自然科学基金项目(81972770)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-1-I2M-018)作者信息：冯丹，E-mail：。*通信作者，王明荣，E-mail：；郝佳洁，E-mail：P4HA2通过激活EGFR/AKT/S6信号通路促进食管鳞癌细胞的增殖冯丹1，范志露1，王意浓1，李赛1，郭婧1，蔡岩1，
2、张钰1，魏文强2，王明荣1，*，郝佳洁1，*(1国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，分子肿瘤学国家重点实验室，北京100021；2国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，流行病学中心，北京100021)P4HA2 promotes proliferationof esophageal squamouscarcinoma cells via activating theEGFR/AKT/S6 signaling pathwayFENG Dan1,FAN Zhilu1,WANG Yinong1,LI Sai1,GUO
3、Jing1,CAI Yan1,ZHANG Yu1,WEI Wenqiang2,WANG Mingrong1,*,HAO Jiajie1,*(1.State Key Laboratory of Molecular Oncology,National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital,ChineseAcademy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing100021;2.Department of Can
4、cer Epidemiology,National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital,ChineseAcademy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100021,China)【摘要】目的：探讨P4HA2在食管鳞癌中的表达情况及作用机制。方法：利用基因表达综合数据库(GEO)的RNA表达谱数据及免疫组织化学染色和Western blot技术分析食管鳞癌组织及正常食管组织中P4HA2的mRNA和
5、蛋白表达情况；通过细胞增殖实验、集落形成实验和裸鼠移植瘤实验，在体外和体内检测P4HA2对食管鳞癌细胞恶性表型的影响；利用Western blot检测P4HA2调控的下游通路及关键分子。结果：与正常食管组织相比，食管鳞癌组织中P4HA2的mRNA和蛋白水平均显著升高(P0.01)；体外和体内实验结果显示，与对照组相比，敲降P4HA2可显著抑制食管鳞癌细胞的增殖、集落形成以及裸鼠移植瘤的生长(P0.01)；分子水平检测表明，敲降P4HA2显著降低EGFR的蛋白水平，以及AKT和S6的磷酸化水平(P0.05)；在食管鳞癌细胞中敲降P4HA2后回复EGFR的表达，AKT和S6的磷酸化水平以及细胞增殖
6、和集落形成表型均得以恢复(P0.01)。结论：P4HA2在食管鳞癌组织中高表达，且P4HA2通过激活EGFR/AKT/S6信号通路促进食管鳞癌细胞的增殖和肿瘤生长。【关键词】P4HA2；食管鳞癌；细胞增殖；EGFR/AKT/S6信号通路中图分类号：R735.1文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)02-0087-09doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.02.002【ABSTRACT】OBJECTIVE：To investigate expression and implication of P4HA2 in esophageal squamous
7、cell carcinoma(ESCC).METHODS：Expressions of P4HA2 mRNA in ESCC tissues and normal esophagealtissues were analyzed by Gene Expression Omnibus(GEO)database.P4HA2 protein in ESCC and normaltissuesweredetectedusingImmunohistochemistry(IHC)andWesternblot.Cellproliferationandcolonyformation assays were pe
8、rformed to analyze effects of P4HA2 on the malignant phenotypes of ESCC cells invitro.Effects of P4HA2 on tumor growth were detected using the nude mouse xenograft model in vivo.Westernblot was used to analyze changes in downstream pathways from knockdown of P4HA2.RESULTS：Expressionlevels of both th
9、e P4HA2 mRNA and protein were up-regulated in ESCC compared with the normal tissues(P0.01).In vitro and in vivo results showed that P4HA2 silencing significantly inhibited the proliferation andcolony formation of ESCC cells，as well as the growth of tumor xenografts(P0.01).At the molecular level，P4HA
10、2 knockdown down-regulated EGFR expression，and reduced the phosphorylation levels of AKT and S6(P0.05).Moreover，P4HA2 knockdown and over-expression of EGFR significantly restored the phosphorylationlevels of AKT and S6 as well as cell proliferation and colony formation(P0.01).CONCLUSION：P4HA2论著癌变畸变突
11、变0 8 8CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.2Mar.2023was highly expressed in ESCC，and it might enhance cell proliferation and promote development of ESCC viaactivating the EGFR/AKT/S6 pathway.【KEY WORDS】P4HA2；esophageal squamous cell carcinoma；cell proliferation；EGFR/AKT/S6 signaling path
12、way食管癌是我国高发恶性肿瘤之一，早期缺乏明显的临床症状，很多就诊时已处于中晚期、且治疗效果较差，5年生存率较低1-2。因此，研究和鉴定食管癌发生发展过程中异常表达的分子并探索其作用机制，对食管癌患者的诊断和治疗具有重要意义。P4HA2基因定位于人类染色体5q31.1，其编码蛋白脯氨酸-4-羟化酶亚基 2(prolyl 4-hydroxylase subunit2，P4HA2)是 P4HA 亚基的三种亚型(P4HA1/2/3)之一。P4HA与P4HB形成22四聚体，组成全酶胶原脯氨酸 4-羟化酶(collagen prolyl 4-hydroxylase，C-P4H)，催化脯氨酸残基的羟基化
13、，促进胶原蛋白的正确折叠，维持其三螺旋结构的稳定性3。P4HA2已被证实在口腔鳞癌4、卵巢癌5、乳腺癌6、肺腺癌7等多种癌症中高表达，且与患者的不良预后相关，参与调节肿瘤细胞增殖、侵袭迁移、上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、糖酵解等过程8-10。目前尚无报道其在食管鳞癌中的表达情况及作用机制。本研究发现P4HA2蛋白与正常食管组织相比在食管鳞癌组织高表达，且降低P4HA2表达可抑制食管鳞癌细胞的增殖、集落形成及裸鼠移植瘤的生长，进而探讨其调控的信号通路以及促进食管鳞癌细胞恶性表型的潜在作用机制。1材料与方法1.1食管鳞癌临床样本食管鳞
14、癌组织及正常食管组织取自河南省林州市食管癌医院，均为病理诊断后的剩余标本。所有患者术前均未接受过任何治疗，并就取材剩余标本用于研究的相关事项签署了知情同意书。本研究已获得中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会的批准(编号为16-171/1250)。1.2公共数据库分析通 过 基 因 表 达 综 合 数 据 库(geneexpressionomnibus，GEO)下载微阵列数据集GSE23400(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE23400)，分析P4HA2 mRNA在食管鳞癌组织及其配对的正常食管组织中的表达情况。1.3免疫组织
15、化学染色将组织微阵列脱蜡、水化，置于3%过氧化氢溶液中封闭10 min，在枸橼酸钠缓冲液(pH=6.0)中95 加热25 min，室温冷却约1 h。滴加P4HA2一抗(美国Proteintech公司，1300稀释)4 孵育过夜，滴加二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，37 孵育30min。在每个步骤之间，用1PBS缓冲液(pH=7.27.4)浸洗3次，每次5 min。二氨基联苯胺(DAB)进行免疫染色，苏木精复染，随后浸入75%、85%、100%乙醇中各3 min梯度脱水，最后封片镜检。免疫组织化学染色结果按表达强度和表达面积分别评分。根据表达强度不同分为4级：不着色，0分；淡黄色，1分；棕
16、黄色，2分；深褐色，3分。根据表达面积不同分为4级：不着色，0分；20%面积着色，1分；20%50%面积着色，2分；50%面积着色，3分。综合评分为表达强度与面积的乘积。对于组织微阵列上分别有23个点的组织块，以各点综合评分的平均值为最终评分，6分记为高表达。1.4细胞培养食管鳞癌细胞系 KYSE30、KYSE140、KYSE450由日本京都大学Shimada教授惠赠，使用补充10%胎牛 血 清(NEWZERUM)、1%青 霉 素-链 霉 素 溶 液 的RPMI-1640 培养基(大连美仑生物技术有限公司)培养；人胚肾细胞HEK293FT购自南京科佰生物科技有限公司，使用补充 10%胎牛血清、1%L-型谷氨酰胺、1%非必需氨基酸以及1%G418(美国Gibco公司)的DMEM高糖培养基(大连美仑生物技术有限公司)培养。以上细胞均置于37，CO2体积分数为5%的培养箱中培养。1.5总RNA提取和过表达载体构建利用RNA纯化试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)从食管鳞癌细胞中提取总 RNA，使用HiFiScript cDNA合成试剂盒(江苏康为世纪生物科技股份有限公司)获得cDNA，步