1、山东医药2023 年第 63 卷第 8 期靶向颗粒酶B分子影像探针的作用机制及应用研究进展付加煜1，2，朱诗宇1，2，奚鸿杰1，2，华迪1，2，邱玲1，2，林建国1，21 南京医科大学药学院，南京211166；2 江苏省原子医学研究所 国家卫生健康委员会核医学重点实验室 江苏省分子核医学重点实验室摘要：颗粒酶B作为一种免疫相关生物标志物，其表达水平与细胞毒性T细胞密切相关，可为恶性肿瘤免疫治疗疗效评估提供重要信息。靶向性分子影像探针能够准确检测免疫治疗前后体内颗粒酶B的表达水平。目前相关分子探针都是基于能够被颗粒酶B特异识别的多肽序列设计的，主要分为近红外荧光（NIRF）探针和正电子发射断层扫
2、描（PET）探针两类。NIRF探针包括可激活类探针（如CyGbPF、CyGbPP、GNR）、自组装类探针（如G-SNAT-Cy5、Cy5.5-CBT-NPs）；PET探针包括酶结合类探针（如68Ga-NOTA-GZP、18F AlF-mNOTA-GZP、68Ga-grazytracer）及酶剪切类探针（如64Cu-GRIP B）。两类分子影像探针均有很好的靶向颗粒酶B的能力，可预测免疫治疗的效果。但这些分子探针也存在靶部位摄取低、体内不稳定、易受体内其他环境干扰等不足，未来仍需深入研究并进行更多的临床试验，才能将此类探针应用于多种肿瘤的免疫治疗疗效评估。关键词：颗粒酶B；分子影像探针；近红外荧
3、光成像探针；正电子发射断层扫描探针；免疫疗法；恶性肿瘤doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.08.024 中图分类号：R730.51；R814 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）08-0094-05免疫治疗是恶性肿瘤治疗的重要手段。使用抗体阻断免疫检查点的免疫治疗已被证实在晚期恶性肿瘤中有效，被批准用于多种恶性肿瘤的治疗1-5。然而目前仅有少部分肿瘤患者可以从免疫治疗中受益，不当治疗还可诱发免疫相关不良反应（如肝炎、结肠炎等），甚至会引起患者死亡。因此，在免疫治疗早期评估患者的治疗反应，不仅可以最大限度地发挥免疫治疗的作用，还能为治疗不响应的
4、患者及基金项目：国家自然科学基金面上项目（22076069）。通信作者：林建国（E-mail：linjianguojsinm.org）25KANBE A，ISHIKAWA T，HARA A，et al.Novel hepatitis B virus infection mouse model using herpes simplex virus type 1 thymidine kinase transgenic miceJ.J Gastroenterol Hepatol，2021，36（3）：782-729.26UEHARA S，HIGUCHI Y，YONEDA N，et al.An imp
5、roved TK-NOG mouse as a novel platform for humanized liver that overcomes limitations in both male and female animalsJ.Drug Metab Pharmac，2022，42：100410.27WASHBURN M L，BILITY M T，ZHANG L，et al.A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection，immune response，and liver disease J .Gastroent
6、erology，2011，140（4）：1334-1344.28ROBINET E，BAUMERT T F.A first step towards a mouse model for hepatitis C virus infection containing a human immune system J.J Hepatol，2011，55（3）：718-720.29PAJVANI U B，TRUJILLO M E，COMBS T P，et al.Fat apoptosis through targeted activation of caspase 8：a new mouse model
7、 of inducible and reversible lipoatrophyJ.Nat Med，2005，11（7）：797-803.30CONNER E A，LEMMER E R，OMORI M，et al.Dual functions of E2F-1 in a transgenic mouse model of liver carcinogenesis J.Oncogene，2000，19（44）：5054-5062.31BILITY M T，LI F，CHENG L，et al.Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver
8、 tropic virus infection in humanized mouse models J.J Gastroenterol Hepatol，2013，28（Suppl 1）：120-124.32BILITY M T，CHENG L，ZHANG Z，et al.Hepatitis B virus infection and immunopathogenesis in a humanized mouse model：induction of human-specific liver fibrosis and M2-like macrophagesJ.PLoS Pathog，2014，1
9、0（3）：e1004032.33SHULTZ L D，SAITO Y，NAJIMA Y，et al.Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class expressing NOD/SCID/IL2r gamma（null）humanized mice J.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（29）：13022-13027.34VIDAL I，BLANCHARD N，ALEXANDRE E，et al.Improved xe
10、nogenic hepatocyte implantation into nude mouse liver parenchyma with acute liver failure when followed by repeated anti-Fas antibody（Jo2）treatment J .Cell Transplant，2008，17（5）：507-524.35SUN S，LI J.Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection J.Int J Infect Dis，2017，59：131-136.（收稿
11、日期：2022-11-13）94山东医药2023 年第 63 卷第 8 期时寻找替代策略6-9。免疫治疗的疗效可以通过检测体内免疫相关生物标志物来进行评估10-11。颗粒酶B是一种由细胞毒性T细胞（CTLs）的细胞质颗粒释放的丝氨酸蛋白酶，在靶细胞中可诱导程序性死亡或凋亡12-14。当CTLs识别目标细胞时，颗粒酶B被释放，进入目标细胞的细胞质后，触发Caspase级联反应，并通过直接和间接的层压处理及激活、线粒体渗透等方式，最终导致肿瘤细胞死亡15-17。因此，颗粒酶B不仅反映CTLs在肿瘤区域的定位和表达水平，还直接反映 CTLs对肿瘤细胞的潜在杀伤能力，是一种可靠的免疫相关生物标志物18
12、。准确检测体内颗粒酶B表达水平是免疫治疗疗效评估的关键。影像学技术能无创、实时、定量地进行全身动态成像19-22。靶向分子影像探针能够准确检测免疫治疗前后体内颗粒酶B的表达水平。目前关于颗粒酶B的分子探针主要分为近红外荧光（NIRF）探针和正电子发射断层扫描（PET）探针两类。NIRF成像操作简便，受背景的自发荧光影响较小，可提供较为准确的显像结果，但是其组织穿透能力较弱23。PET显像具有组织穿透力强、灵敏度高、分辨率高等优点，与电子计算机断层扫描（CT）和核磁共振成像（MRI）联合成像时可提供更为准确的显像结果，不过PET需要借助放射性核素标记分子探针，便捷性较差24-26。现就靶向颗粒酶
13、B的分子影像探针的作用机制及应用研究进展综述如下。1 靶向颗粒酶B的NIRF探针的作用机制及应用 根据作用机制，靶向颗粒酶B的NIRF探针主要分为可激活类和自组装类。可激活类NIRF探针是将荧光基团与靶向肽序列相连接，在探针结构末端引入荧光淬灭基团，或在靶向肽两端连接一对荧光共振对基团，使得探针起初处于荧光信号关闭的状态，随后在体内被颗粒酶B识别剪切靶向肽后，荧光信号开启。自组装类NIRF探针是将靶向肽序列与荧光基团连接，通过点击缩合反应后自组装形成纳米颗粒淬灭荧光，酶剪切后解组装开启荧光，或在体内经酶切后自组装聚集增强荧光进行显像。1.1可激活类NIRF探针CyGbPF和CyGbPP有学者通
14、过在颗粒酶 B 特异识别的多肽序列 IEFD 和IEPD 上连接花菁染料（CyOH），构建了 NIRF 探针CyGbPF和CyGbPP27-30。该类探针的作用机制是CyOH在连接上IEFD或IEPD及对氨基苯甲醇（PABA）后，其氧原子供电子能力减弱，分子探针最初处于荧光淬灭状态，将底物序列剪切后，自毁基团PABA离去使得淬灭的荧光重新被开启。CyGbPF和CyGbPP被注射进入体内后可被动靶向肿瘤，被肿瘤微环境中的颗粒酶B识别剪切，导致NIRF信号增强。体外实验证实，两个荧光探针均具有较好的生物安全性和靶向特异性。研究者分别用 NLG919、R848、BMS-1、Pexidartinib和
15、BEC五种免疫治疗药物对乳腺癌（4T1）小鼠进行治疗，在治疗过程中注射CyGbPF和CyGbPP进行显像以监测疗效，结果显示，免疫治疗后，肿瘤部位荧光信号明显增强，而其余组织部位荧光信号较弱。体外免疫荧光染色和流式细胞术分析也证实，探针在体内成像中的荧光信号强度也与其他免疫相关生物标志物如CD8+、CD4+受体存在相关性。此外，CyGbPF和CyGbPP还具有高肾脏清除效率，使得无创的光学尿液分析较免疫荧光染色更方便。CyGbPF和CyGbPP作为第一种能够实时成像和进行活体动物体内颗粒酶 B 尿液分析的NIRF探针，在推进荧光成像在免疫治疗中的应用具有深远意义。1.2可激活类 NIRF 探针
16、 GNRNGUYEN 等31在IEPD两端连接一对荧光共振对，随后与纳米聚合主链PIMA相连使其形成纳米聚集物，最终获得探针GNR。在颗粒酶 B 存在的条件下，GNR 结构上的IEPD会被剪切，造成分子结构断裂，从而使供体基团的荧光重新被开启，并通过荧光信号强度来反映颗粒酶B表达水平。由于实体瘤的高通透性和滞留效应，GNR进入体内后会聚集在肿瘤部位，而在其他组织中则会被快速清除。该研究还在GNR的结构上偶联PD-L1抗体，纳米颗粒聚集在肿瘤部位后，将阻断PD-L1/PD-1通路，可以同时实现对肿瘤的免疫治疗和疗效监测。GNR在体内外均具有良好的颗粒酶B靶向特异性和生物相容性。有学者对荷瘤小鼠进行免疫治疗，发现对治疗响应的小鼠结直肠癌（MC-38）组织有明显的荧光信号开启和增强，而在对治疗不响应的小鼠黑色素瘤（B16/F10）组织中则没有检测到荧光信号，说明该探针能够有效区分治疗响应者和非响应者。此外，离体组织分析结果表明，探针在体内成像的荧光信号强度与颗粒酶 B表达水平高度一致。与肿瘤体积及形态监测相比，GNR的影像结果可以提供更早、更全面的肿瘤整体免疫反应信息。该纳米探针也可在未来临