1、海南医学2023年2月第34卷第4期Hainan Med J,Feb.2023.Vol.34,No.4基于网络药理学和生物信息学的黄杨碱抑制肾癌细胞的作用机制及实验验证研究马旭东1，2，杨进2，陈林2，吴波3，李嘉1，2，王威威1，2，梁国标11.遵义医科大学，贵州遵义563000；2.成都大学附属医院泌尿外科，四川成都610081；3.郫都区人民医院泌尿外科，四川成都611730【摘要】目的利用网络药理学和生物信息学研究黄杨碱(CVB-D)抑制肾癌细胞的作用机制，并通过人肾癌细胞系786-O，Caki-1进行体外实验验证相关预测结果。方法PharmMapper数据库检索CVB-D的作用靶点，
2、DisGeNET数据库获得肾癌疾病靶点，通过venny平台整合CVB-D治疗肾癌的潜在靶点，将潜在靶点数据导入String数据库构建蛋白质-蛋白质互作网络(PPI)，CytoScape软件可视化并修饰String数据，并用CytoHubba插件进一步分析网络中的Hub基因，得到的Hub基因用TCGA数据库作表达差异及生存分析。此外再用CVB-D与肾癌的交叉靶点数据进行GO和KEGG富集分析，得到CVB-D治疗肾癌潜在靶点的分子功能及相关作用信号通路等分析结果。最后采用CCK-8、克隆形成、细胞形态实验、流式细胞术、Western blot实验验证CVB-D对肾癌的作用。结果分析得到CVB-D潜
3、在作用靶点136个，疾病作用靶点2 085个，CVB-D治疗肾癌的预测作用靶点68个，核心靶点5个。靶点共涉及生物过程 238种，细胞组成30种，分子功能59种，以及参与肿瘤、PI3K-AKT、前列腺癌等细胞信号通路222条。CCK-8、克隆形成、细胞形态体外实验结果表明，CVB-D能显著抑制肾癌细胞的活力与增殖能力，呈浓度依赖性；流式细胞凋亡分析表明CVB-D能促进肾癌细胞凋亡，从而抑制肾癌细胞；Western blot 实验表明CVB-D作用后细胞中EGFR、p-PI3K、p-AKT相对表达水平降低，呈浓度依赖性。结论黄杨碱可能通过EGFR靶点和PI3K-AKT信号通路诱导人肾癌细胞凋亡，
4、从而在肾细胞癌的治疗中发挥重要作用。【关键词】网络药理学；生物信息学；黄杨碱；肾细胞癌；表皮生长因子受体；PI3K-AKT通路【中图分类号】R737.11【文献标识码】A【文章编号】10036350（2023）04046208Mechanism and experimental verification of Cyclovirobuxine D in inhibiting renal carcinoma cells based onnetwork pharmacology and bioinformatics.MA Xu-dong1,2,YANG Jin2,CHEN Lin2,WU Bo3,L
5、I Jia1,2,WANG Wei-wei1,2,LIANG Guo-biao1.1.Zunyi Medical University,Zunyi 563000,Guizhou,CHINA;2.Department of Urology,AffiliatedHospital of Chengdu University,Chengdu 610081,Sichuan,CHINA;3.Department of Urology,Pidu District People sHospital,Chengdu 611730,Sichuan,CHINA【Abstract】ObjectiveTo study
6、the mechanism of Cyclovirobuxine D(CVB-D)in inhibiting renal carcinomacells based on network pharmacology and bioinformatics,and to verify the predicted results through human renal carci-noma cell lines 786-O,Caki-1 in vitro.MethodsFirstly,the therapeutic targets of CVB-D were retrieved from Pharm-M
7、apper database,and the renal cancer targets were obtained from DisGeNET database.Then the potential targets ofCVB-D for the treatment of renal cancer were integrated through Venny platform,and the protein-protein interaction net-work(PPI)was constructed through String database.The CytoScale software
8、 was used to visualize and decorate theString data,and The CytoHubba plug-in in CytoScape was used to further analyze Hub genes in the network.After-wards,the expression differences and survival of Hub genes were analyzed by TCGA database.The data of the potentialtargets of CVB-D for the treatment o
9、f renal cancer were analyzed by GO and KEGG enrichment analysis,and the molec-ular functions and related signaling pathways of potential targets for the treatment of renal cancer by CVB-D were ob-tained.Finally,CCK-8,clonogenesis,cell morphology,and western blot were used to verify the effect of CVB
10、-D on re-nal carcinoma.ResultsA total of 136 potential targets of CVB-D,2 085 disease targets,68 predictive targets ofCVB-D in the treatment of renal cancer,and 5 core targets were recognized after analysis.Targets are related to 238kinds of biological processes,30 kinds of cell compositions,59 kind
11、s of molecular functions,and participated in 222 cellsignaling pathways such as tumor,PI3K-Akt,prostate cancer.The results of in vitro experiments on CCK-8,clonal for-mation,and cell morphology showed that CVB-D significantly inhibited the viability and proliferation of renal carcino-ma cells in a c
12、oncentration-dependent manner.Flow cytometry analysis showed that CVB-D could promote the apopto-sis of renal carcinoma cells and inhibit the renal carcinoma cells.Western blot assay showed that the relative expres-论著 doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2023.04.002基金项目：成都大学附属医院攀登人才计划(编号：RCJH-01-04)；成都优秀卫技人
13、才发展专项资金；成都市医学科研课题(编号：2022181)；成都市医学科研课题(编号：2018011)；成都大学临床医学院附属医院创新团队项目(编号：CDFYCX202207)。第一作者：马旭东(1992)，男，硕士，医师，研究方向：泌尿系肿瘤。通讯作者：陈林(1986)，男，博士，副主任医师，研究方向：泌尿系肿瘤，E-mail：。462Hainan Med J,Feb.2023.Vol.34,No.4海南医学2023年2月第34卷第4期肾细胞癌是泌尿系统最常见和最具风险的肿瘤之一，约占全世界所有确诊癌症数的5%1，主要发生在男性中2。并且在未来几年中，肾细胞癌(renal cellcarci
14、noma，RCC)的发病率和死亡率仍将继续攀升，至2040年全球肾癌死亡人数估计高达30多万2。肾细胞癌可以被分为不同的分子和组织学亚型3，透明细胞癌、乳头状肾细胞癌和嫌色细胞癌是肾细胞癌中最常见的亚型(90%)，而剩余的亚型10%。重要的是，每种亚型在预后和治疗方面都具有特异性4。由于缺乏早期症状，大量肾细胞癌患者在发现时已有远处转移，手术治疗困难。因此，药物治疗对于大多数肾细胞癌患者非常重要。近年来，随着科学技术的进步和国内外研究者的不断努力，不断涌现出许多有潜力治疗肾细胞癌的新疗法，例如针对哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)和蛋白酪氨酸激酶(RTK)信号的靶向治疗5。最近，基于免疫治疗的新
15、策略也被开发出来，旨在针对癌症免疫细胞之间的相互作用(免疫检查点抑制剂)，这种方案在RCC治疗中取得了一些成功6。虽然使用免疫治疗的患者生存率明显高于单独化疗，但总体预后仍较差。因此，医学界迫切需要找到一种新的、有效的抗肾细胞癌的药物。有证据表明，一些天然产物有确切的治疗作用，如抑制细胞增殖、诱导凋亡、促进线粒体损伤、促进氧化应激等7-8。黄杨碱(cyclovirobuxine D，CVB-D)是一种生物碱，来源于中国黄杨和其他同属植物。已发表的研究表明，CVB-D能通过CTHRC1-AKT/ERK-Snail信号通路抑制结直肠癌的发展9。此外，CVB-D 在胃癌细胞、乳腺癌细胞中都有一定的抑
16、制作用10-11。目前 CVB-D 的抗癌作用和详细机制较为复杂，而CVB-D对肾癌的具体作用及机制尚不明确，故本研究希望进一步探索CVB-D对肾癌的作用机制。随着生物信息学领域的发展，网络药理学在药物发现及其设计过程方面有了显著的进步12，使得网络药理学的预测结果可为新药的进一步研究提供理论依据。因此，本研究首次采用网络药理学结合生物信息学方法，建立药物-靶点-疾病网络，探讨CVB-D治疗肾细胞癌的核心靶点、生物学功能、途径和机制；并通过体外实验验证，进一步明确CVB-D在肾癌中的具体作用机制，来为肾癌治疗寻找新的方向。1材料与方法1.1网络药理学与生物信息学分析1.1.1CVB-D 的 预 测 靶 点从 PharmMapper(http:/www.lilab- 据 库 筛 选CVB-D的潜在治疗靶点。基因符号名称在UniprotKB数据库(https:/www.UniProt.org/)中手动规范化。1.1.2肾癌的潜在靶基因肾癌相关的靶基因来自DisGeNET(https:/www.disgenet.org/)。搜索策略:设置关键字为“renal cell carcinoma”，