1、 ，.，.农业与技术 农业科学基于高通量测序卷柏内生真菌多样性研究张丽张武王长宝（.佳木斯大学理学院，黑龙江 佳木斯；.玉林师范学院生物与制药学院，广西 玉林）摘 要：植物的内生真菌对宿主植物的影响极为重大，据研究显示，内生真菌对植物的次生代谢也具有一定的影响。本论文基于高通量测序技术研究卷柏内生真菌的多样性，在高通量测序技术中通过 多样性、多样性以及不同部位内生真菌的差异显示出卷柏植物内生真菌的多样性种类，本研究从 指数、指数、指数和 指数 个多样性指标变化可知，指数多样性呈负相关，其余三者呈正相关。从 多样性三维坐标图可更加直观显示不同部位内生真菌群落结构的差异性与整体相似性，在 水平上，
2、的解释度为.，的解释度为.，的解释度为.。本研究基于披碱草内生真菌在小麦抗旱性有影响的研究下，旨能够在九死还魂草（卷柏）中筛选出抗旱基因提供条件基础。关键词：卷柏；内生真菌；高通量测序；多样性中图分类号：文献标识码：.收稿日期：基金项目：黑龙江省教育厅基本科研业务费基础研究项目（项目编号：）作者简介：张丽（），女，硕士在读。研究方向：生物物理学；通讯作者张武（），男，教授，硕士生导师。研究方向：土壤动物学和环境生态；王长宝（），男，博士，副教授。研究方向：生物信息学。卷柏为卷柏科卷柏属具有观赏价值与药用价值的蕨类植物，卷柏植物喜阳，在向阳的山坡岩石上或者岩石缝细中尤为常见，与宿主植物形成互惠共
3、生体，存在于健康植物体的各类组织和器官内而不引起明显感染症状的真菌，几乎所有被研究的植物体内都含有内生真菌，具有分布广、种类多等特点。卷柏在民间也有长生不死草、九死还魂草、万年青等别称。卷柏有其特殊的生长习性，缺水干枯时看起来整个叶片会蜷缩起来，和一般的干草没有太大的区别，但是只要再次遇到水就能马上恢复状态，正是因为卷柏具有这些区别于其它植物的特性及顽强的生命力，成为观赏植物中最受人们喜爱的植物之一。在 本草纲目 中卷柏具有活血止血、消肿止痛等作用被列入药用植物中也有相应记载，同时卷柏在抗炎、抗肿瘤、抗氧化等方面的药理作用已被证实具有良好的临床效果，。内生真菌之间形成了一个正相关的关系网络，显
4、示了卷柏内生真菌的多样性以及内生真菌的群落结构，也为后续的内生真菌的进一步开发提供了理论基础。在卷柏生长环境特殊且资源有限的背景下，科学开发和有效利用卷柏内生真菌资源将是当下卷柏资源研究的重点方向。卷柏内生真菌多样性不仅提供了大量用于可开发的微生物资源，且其代谢物也可用于筛选抗旱菌株，表明其具有巨大潜力和应用前景。这种长期宿主与内生真菌共生的情况不仅影响宿主植物的抗逆性，还会影响宿主植物的次生代谢产物，甚至会使内生真菌的次生代谢产物与宿主植物的次生代谢产物相似或者相同。材料与方法.内生真菌作用内生真菌在宿主植物的茎叶中生存并完成生命周期。这种真菌很少在未被认可的宿主植物中形成的细菌或真菌。容易
5、感染植物组织的真菌存在于细胞和细胞之间，其与植物共存或不共存，生活在不会引起任何疾病迹象的健康植物中。内生真菌种类丰富，可能有超过 万种。内部真菌通常包括存在于各种植物组织中的内部细菌和真菌。目前，在植物中未发现内部真菌，内部真菌植物具有高度多样性。内部真菌物种的多样性已成为研究的焦点，尤其是促进内部真菌物种多样性的高序列技术。然而，除了内部真菌的多样性外，人们更多地关注内部真菌的生物学功能。从长远来看，在进化过程中，内部真菌与宿主形成共生关系，如促进植物生长、提高植物抗性和增强植物加工能力对于受污染的土壤和减轻盐应激。室内真菌已被证明能够产生技术性二次代谢物，包括酪蛋白、生物碱、芳香化合物和
6、肽，以及各种抗原生物抗癌物质，广泛应用于农业、医学等领域。植物与植物之间许多形式的相互作用都具有重要的生态资源和经济资 农业科学 农业与技术 ，.，.源。植物内生真菌，是指部分或者全部生活史中对植物不同组织或不同器官内外结构无明显毒害作用并在某种程度上有一定或密切或不密切的相互依存共生关系的一类微生物群体，等于 年在健康植物组织的根部首次发现，为今后进一步研究植物内生真菌与植物组织器官的协同关系开辟了一条新的路径。.高通量测序技术本研究基于 平台的高通量测序，技术（该技术也被称作二代测序技术）研究卷柏内生真菌的种类。为了实施人力资源项目并继续发展筛查技术，筛查技术提高了研究水平。与此同时，生物
7、学中对性别和思维的理解正在提高到一个新的水平，而且在医学领域越来越广泛。如今，高分辨率分析平台已广泛用于产前检查、单个遗传病的检查或诊断、核治疗、药物测试。长期序列分析不仅是一种重要的化学工具，也是实现精确医学视觉的技术因素之一。长期监测技术和数据分析的进步提高了监测的准确性和可靠性，并降低了监测和数据分析成本。在生物病原体检测领域，序列分析技术将是一项必要的技术，并将发挥更重要的作用。高通量测序技术对要求测序量大的植物很友好，可以同时测量大量的 分子，其优势是读长较短，此高通量测序的标志性特征是通过读取大量的 片段来拼接完成的序列信息，在大量高速测序的同时与传统方法相比不仅保持了高度的准确性
8、还极大地降低了测序的成本，效率提高了约 倍。高通量测序技术与传统培养技术、一代测序技术（）相比具有更加丰富的定量功能，从而能更加全面、广泛地剖析卷柏内生真菌多样性。.内生真菌总 提取采用少量 提取试剂盒对高通量测序样本进行卷柏内生真菌总 提取，具体步骤如下。植物组织样本经无菌处理后，去除表面水分，使用无菌刀片取约 样本，切碎后与 裂解液同时放入管中，研磨；拿出裂解管后在放入离心机，离心；小心取出裂解管，吸取 上清液与其套在一个收集管里，进行离心，丢弃过滤柱，向上一步的收集管中加入 的 裂解液并充分混匀；将 号柱套在一个新的收集管中；从新试管中吸取重新组成的 混合液加到另一个管中，进行离心，倒掉
9、管中废液；从试管中留下部分进行质量检测，其余都放入的培养箱中进行培养。.质量检测和 扩增提取好的 样本，进行琼脂糖凝胶电泳检测。操作如下：配制.琼脂糖凝胶；每个样本均取 的 溶液分别与 混匀；将上一步的 混合液上样到配制好的.琼脂糖凝胶的胶孔内，进行电泳检测。为了后期试验的顺利进行并得到完整准确的数据，软件的 插件可以对数据进行进一步处理，并生成 表和代表序列是得到高质量的测序数据的关键。电泳条带清晰出现即为试验成功，扩增技术，研究内生真菌基因 区，引物信 息 为 和 产物的纯化和混样，用琼脂糖凝胶电泳检测 扩增之后的产物，然后将 产物进行回收通过利用纯化的试剂盒，利用后使其能够将回收的 序列
10、精确的等比例混合后进行上机测序。.材料采集及处理.样本准备（）样本材料于 年 月采摘于黑龙江省佳木斯市四丰山，株植株分为地上部分、地下部分 组对照组，选择健康长势比较好的卷柏植物进行采摘，采摘过程需要将植物的根部一并带出，并且在这个过程中要保证植物的完整性，进行处理前需要用清水冲洗干净，分别放置于不同的密封袋中，做好标记，以 种同种植物的不同植株作为对比，从而保证试验结论不是偶然性，而更具有普遍意义。采集回来的试验材料立即带入实验室进行消毒处理，先去除表面泥土自来水下冲洗干净，消毒步骤：无菌水漂洗 次，.氯化汞，无菌水漂洗 次；.次氯酸钠，无菌水漂洗 次；乙醇消毒，无菌滤纸吸干叶表面水分，以保
11、证试验材料的消毒更加彻底。消毒试剂的选择以及消毒时间长短均是获得内生菌株种类多少的关键，如消毒时间不足会导致植物表生微生物混入，而消毒时间过久，又会导致部分可分离培养的内生菌株丢失。.文库构建（）.片段化方法超声处理、化学处理或片段化酶处理使 片段化，目的是使 片段长度符合测序平台的读取要求。.末端修复方法使用 聚合酶、酶等，延伸补平 突出末端，切割 突出末端，使用 酶等，磷酸化 突出末端。.尾添加方法使用 酶等，对 片段 末端添加 尾，目的是为后续接头连接做准备。，.，.农业与技术 农业科学.接头连接方法使用 连接酶，进行 克隆连接。因为连接接头的 片段，可与 结合，进行上机测序。.文库扩增
12、意义 循环与建库效率呈负相关。.纯化有效去除其它杂质。.分选有效用于测序文库构建。.数据分析（）使用 .软件，对测序得到的 进行过滤；使用 .软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的 数据分析是高通量测序技术最重要的一个环节，在进行高通量测序完成后会得到大量的数据，然而这些数据的分析成为高通量测序技术的一个主流，测序数据分析的好论文才有价值，反之则为一堆废弃的数字；使用 软件，对样品 多样性指数进行评估；软件 （）是可用于解析真菌 的工具，基于该软件对样品进行生态功能分析；使用 软件对 在.的相似度水平下进行聚类，获得。结果与分析.测序数据与生物信息学分析测序的原始数据因为存在某些干
13、扰的相对无关数据，为保证测序信息结果的高质量，用 、软件进行样本原始数据的质量把控从而去除 序列和引物等低质量非扩增区域的数据，使得到更加准确可靠的有效数据结果。在相似水平达到 的 代表序列中进行操作分类单元，进 而 采 用 分 析、方 差 分 析、分析、分析、分析等分析优势物种物种多样性，采用多样性指数统计、多样性指数差异分析、曲线、稀释曲线、曲线、物种积累曲线反应 多样性，采用功能预测、功能组成柱状图、分析、分析、分析 图进行整体功能预测分析。综上生物信息学统计分析，得到卷柏内生真菌群落结构组成。.内生真菌 多样性分析 多样性可以反映内生真菌的丰度以及多样性情况，常用的度量指标有丰度指数和
14、多样性指数，丰度指数包括 指数，多样性指数包括 指数、指数、指数，用于表示卷柏内生真菌丰富度的一个是 指数，另一个是 指数，指数和 指数用于表示卷柏内生真菌多样性，结果如图 所示，群落 指数分析结果显示，地上部分 地下部分。群落 指数、指数、指数分析结果和上述结果相似，地上部分地下部分。指数中群落多样性越低相反数值越大，两者呈现负相关；指数、指数和 指数则与均匀度、群落丰富度和多样性呈正相关，如图 所示可看出各样本文具的覆盖率均大于.，覆盖率较高说明能够代表卷柏样本中内生真菌的真实信息。图 卷柏内生真菌 多样性 农业科学 农业与技术 ，.，.图 卷柏内生真菌 多样性.内生真菌 多样性分析在操作
15、分类单元中（，）对 多样性进行分析评估的方法常采用主成分分析法，比较不同组织，即卷柏地上部分与卷柏地下部分内生真菌群落结构组成，用主坐标分析（，）显示地上部分（）和地下部分（）的样本均能更好的聚合，说明内生真菌群落组成相似性较高，并且根据图 可更加直观显示不同部位内生真菌群落结构的差异性与整体相似性，在 水平上，的解释度为.，的解释度为.，的解释度为.。.不同部位内生真菌结构差异在门水平上统计卷柏地上部分和地下部位内生真菌群落组成，地上部分和地下部分也存在相对独立性，卷柏地上部位（）的优势真菌占总群落的比例最大的是子囊菌门，卷柏地下部位（）的优势真菌占总群落最多的是担子菌门，对比地上部位和地下
16、部位内生真菌多样性具有相对独立性，卷柏内生真菌对卷柏代谢产物的影响有待进一步探究。结论与讨论本研究首次采用高通量测序方法对卷柏内生真菌的多样性与群落结构展开分析，以 的一致性进行 聚类，尽管植物内生真菌与植物的健康影响有着密不可分的联系，但是不同种内生真菌对卷柏的确切影响还有待学者们进一步研究。本研究是利用高通量测序技术全面整体地分析了卷柏植物内生真菌的多样性，从 指数、指数、指数和 指数 个多样性指标变化可知，内生真菌与植物体的协同共生明显改变了卷柏植物内生真菌群落的多样性。本论文从黑龙江省佳木斯市地区采集的卷柏中进行高通量测序，得到内生真菌在门的水平上分类。主要研究结论如下。从门的分类学角度来看，卷柏内生真菌中主要分布于子囊菌门、担子菌门、罗兹菌门、球囊菌门、毛霉门、壶菌门、被孢霉门和一些目前没有被科学家分类和没有被识别记录的真菌；卷柏植物中的真菌主要存在于担子菌门和子囊菌门中。参考文献 郑鑫，温静，李文兰，等 中华卷柏的化学成分和药理作用研究进展 国际药学研究杂志，（）：，吕华伟，李宇霞，罗蒙，等 垫状卷柏化学成分的研究 中成药，（）：谢宇，裴华 卷柏：活血通经的九死还魂草 大众