1、基金项目：国家自然科学基金面上项目（）中国中医科学院科技创新工程项目（）国家重点研发计划项目（）中国中医科学院自主选题（）中国中医科学院广安门医院（北京，）南京中医药大学附属苏州市中医医院通信作者 ：实验研究基于核因子 受体活化因子受体 骨保护素探讨复方雷公藤外敷剂改善型胶原诱导型关节炎模型大鼠骨破坏程增玉姜雯徐浩东李达王一燃唐晓颇 摘要目的：观察复方雷公藤外敷剂对型胶原诱导型关节炎模型大鼠的骨形态学影响，探讨其可能的作用机制。方法：将 只雌性 大鼠随机分为正常组（组）、模型组（组）、复方雷公藤外敷剂组（组）、雷公藤多苷组（组）、扶他林乳胶剂组（组），每组 只。除 组外，对其余大鼠进行尾根部皮
2、下注射型胶原诱导，后加强免疫造模。组以 （）外用、组 （）灌胃、组乳胶剂 （）外用，组与 组以生理盐水涂抹膝踝关节，连续给药。观察大鼠一般状态、双下肢肿胀程度；观察各组膝、踝关节病理形态，借助微型计算机断层扫描（）观察骨质改变，采用酶联免疫吸附法（）测定、蛋白免疫印迹法（）观察外周血及组织骨破坏与骨保护相关因子与蛋白表达。结果：与 组比较，组一般状态不佳，关节炎评分与足趾容积均显著增高，显示踝关节、跖趾关节破坏严重，血清 、显著增高，滑膜组织中 显著升高。与 组相比，各治疗组随着给药时间的增加，关节炎评分与足趾容积均有下降，显示踝关节、跖趾关节骨表面积骨体积比值低于模型组，差异有统计学意义（）
3、，其中组与 组改善最为明显，差异有统计学意义（）；各治疗组血清、关节组织中 均低于 组。结论：复方雷公藤外敷剂能够改善模型大鼠关节骨破坏，其作用机制可能与降低、水平，抑制 ，调控骨平衡有关。关键词类风湿关节炎；胶原诱导型关节炎；雷公藤；外治；核因子 受体活化因子受体；骨保护素 中图分类号 文献标志码 文章编号 （），；，：（），（），（），（）（），（），（）（），（），（）：，（），（），：，：；类风湿关节炎（，）是我国常见的慢性致残性疾病，血管翳、滑膜炎和进行性骨破坏是类风湿关节炎的主要病理特征。类风湿关节炎引发的 高致残率 是临 床亟 待 解决的 重 点 和难点，尽管生物制剂的应用有了很
4、大突破，但临床达标仍有待提高。中医药在延缓类风湿关节炎骨破坏方面有显著优势，既往研究提出湿热瘀为类风湿关节炎核心病机，研究发现采用清热活血法能够改善类风湿关节炎骨破坏，降低致残率 。核因子 受 体活化因 子 受 体（，）骨保护素（，）信号通路是调节破骨细胞生成、活化的经典信号通路。既往研究显示复方雷公藤外敷剂能降低关节炎症反应 、抑制血管生 成 。本 研 究 在 前 期 研 究 的 基 础 上，基 于 调节骨破坏，探索其防治类风湿关节炎的作用机制，以期为临床推广中医复方外治提供科学依据。材料和方法 材料 动物与分组健康周龄雌性 大鼠 只，体重为 ，购自北京华阜康生物科技股份有限公司（许可证号为
5、 （京），饲养于中国中医科学院广安门医院 级实验动物中心，相对湿度约为，恒温，明暗交替，充足食水。将大鼠根据体重随机分为正常组（，组）、模型组（，组）、复方雷公藤外敷剂组（，组）、雷 公 藤 多 苷 组（，组）和扶他林乳胶剂组（，组），每组各 只。实验药物复方雷公藤外敷剂：所需中药材由中国中医科学院药学中心提供，生产厂家为北京丰泰金源药业有限公司；凝胶剂由中国中医科学院中药研究所制备，每克凝胶含生药量 ，环境保存，给药前取出所需凝胶，放置回温。雷公藤多苷片：黄石飞云制药，片，生产批号为 。将其研磨成粉，以纯净水溶解备用，环境保存，给药前水浴加热至。扶他林乳胶剂：北京诺华制药，支，每支含双氯芬酸
6、钠，批号为 ，常温保存。主 要 试 剂 及 仪 器免 疫 源 性 牛型 胶 原（公 司，货 号 为 ），不 完 全 弗 氏 佐 剂（公司，）；苏木精染色液（北京九洲柏林生物技术有限公司，），伊红染色液（）；多聚甲醛溶液（，），试剂盒（公 司，），（公司，），（公司，）；抗 体（公 司，），抗体（公司，）；蛋白检测试剂盒（，）；扫描仪（，型号为 ），手提式均质仪（德国 公司，型号为 ），足趾肿胀容积测量仪（成都泰盟，型号为 ），高速冷冻离心机（），全自动多功能酶标仪（，），摇床（，型号为）。方法 免疫原制备与造模 免疫原于造模当天制备，制备过程保证在超净台上进行。于冰浴环境中，将等量的牛型胶原与
7、弗氏佐剂充分混合，用高速均质仪搅拌乳化 左右，最终乳化程度达到滴中国中医骨伤科杂志 年月第 卷第期入水里不分散，即制成浓度为 牛型胶原乳剂。首次免疫于大鼠适应性饲养后进行，于大鼠左侧尾根部皮下注射 型胶原乳剂，一周后于大鼠右侧尾根部皮下注射 型胶原乳剂。组采用等量生理盐水按同样方法进行。给 药 剂 量 与 方 法 组：按 （）外用给药，涂抹双膝、踝关节。组：给予雷公藤多苷 （），灌胃给药。组：乳胶剂按 （）外用给药，涂抹双膝、踝关节。组及 组：以生理盐水涂抹双膝、踝关节。各组于加强免疫后第天起进行干预，记为，给药时间为每天上午：，连续。观察内容与指标检测 足趾肿胀度观察每周进行次关节炎指数（，
8、）评分，按照无肿胀分、轻微红肿分、中度红肿分、重度红肿分、关节畸形分的标准。每周进行次足趾肿胀容积（，）测量：采用大鼠足趾容积测量仪测量大鼠足趾关节体积。将大鼠双后肢踝关节以下部分没入水中，所得水体积即为大鼠关节肿胀体积，而后取双后肢体积的平均值。关节病理苏木精伊红染色法（，）染色骨组织常规石蜡包埋，切片；将切片分别放入二甲苯（）、二甲苯（）、乙醇（，）脱蜡，蒸馏水洗涤 ；苏木精染色 ，流水冲洗；盐酸酒精分化；蒸馏水洗涤 次；伊红染色 ；乙醇（、）、乙醇（、）、二甲苯石碳酸脱水处理 ；二甲苯（、）透明处理；中性树胶封片，显微镜下观察拍照。微型计算机断层扫描（）观察骨破坏情况采用多聚甲醛固定各组
9、大鼠踝关节，进行 检测，从跟骨起连续切片 张，将厚度为 的跗骨区域设定为三维重建区域，进行三维图像 重 建 和 分 析。检 测 骨 表 面 积（，）、骨体积（，）。成像分析软件为 ，扫 描 参 数 为 电 压 ，电 流 。血 清 骨 破 坏 相 关 因 子 、检测将保存于 冰箱的血清样品室温融化，采用酶联免疫吸附法（）检测 、指标：溶解稀释标准品，孵育；弃溶液，洗涤溶液洗涤次，干净纸巾吸干；加入制备好的抗体，温育；弃孔中废液后洗涤次；每孔加 酶结合物工作液，覆膜，避光孵育 ；弃溶液，洗涤次；每孔加 底物溶液，覆膜，避光孵育 ；每孔加终止液，终止反应；波长下测量吸光度。膝骨关节囊 、蛋白表达水平
10、检测将保存于 冰箱的膝关节组织取出，匀浆后冰上裂解 ，离心 ，取上清进行蛋白定量及蛋白样本制备。按照 蛋白定量试剂盒使用说明书操作，测定蛋白浓度，以 调整后，检测 、蛋白表达。统计学方法使用 统计软件建立数据库，绘图。计量资料用形式表示，符合正态分布采用单因素方差分析，若满足方差齐性，采用 检验，不满足方差齐性，采用 检验。不符合正态分布采用非参数检验。差异有统计学意义。结果 各组大鼠一般情况与关节肿胀度 组大鼠整体无特殊改变，各造模组大鼠在免疫后逐步出现体型消瘦、精神不振、食欲减退伴体力下降。各治疗组大鼠随着用药时间的增加，整体症状与同期模型组大鼠相比有所改善。结合关节炎指数评分与足趾肿胀容
11、积测量发现，组大鼠实验过程中双足体积未见明显变化。各造模组大鼠自造模第天起，大鼠关节肿胀逐渐加重，双足排水量逐渐增加，双足体积逐渐增大，关节炎指数评分增高，于造模第 天双足肿胀最为明显。而后出现双足体积逐渐减小，但持续高于同期 组大鼠双足体积，各给药组大鼠关节炎指数评分、足趾肿胀程度均低于同期 组大鼠。组在减轻关节炎指数评分与足趾肿胀度方面，优于 组与 组（见图）。图 各组大鼠关节炎指数与足趾肿胀容积 大鼠膝、踝关节病理切片结果观察各组大鼠膝、踝关节病理切片可发现：组大鼠关节面平滑有规则，关节构造整体明显可见、间隙清晰，无骨质的破坏和侵蚀，软骨和滑膜包围均匀无异常。组大鼠关节吸收明显，关节滑膜
12、炎症明显，关节软骨出现不同程度的破坏和纤维化，伴有程度不同的软组织水肿，滑膜组织异常增生并填充关节腔，间隙融合消失，关节面不连续无规则，胫骨远端骨小梁吸收破坏。各治疗组关节间隙中能够发现有少量炎性细胞浸润和较多的滑膜微血管等软组织生长，关节软骨可见局部病变坏死伴部分损坏侵蚀，但总体均好于 组。组关节面清晰、规则，显示出骨保护作用。各组大鼠关节病理切片见图。图 各组大鼠关节病理切片（上为膝关节，下为踝关节）大鼠踝骨关节 检测结果通过大鼠踝关节 检测发现：组大鼠骨关节面质地整体光滑平整，关节间隙清晰可见，骨与骨之间衔接紧凑有规则，未见骨质缺损和破坏。组大鼠踝关节骨关节面出现广泛骨侵蚀伴骨质疏松，骨
13、实质侵蚀呈虫蚀样和穿凿样缺损，骨质疏松明显。各治疗组大鼠骨破坏较 组显著轻微，差异有统计学意义（），其中 组和 组骨表面积 骨体积比值显著低于模型组，差异有统计学意义（），提示关节骨破坏得到了一定的抑制，见表及图。表各组骨表面积、骨体积等指标比较（，）组别骨表面积骨体积骨表面积骨体积正常组 模型组 ）复方雷公藤外敷剂组 ）雷公藤多苷组 ）扶他林乳胶剂组 ）注：）与正常组相比，；与模型组相比，），）。图各组大鼠踝关节、足趾关节三维成像与踝关节骨表面积骨体积比值 血清骨破坏相关因子 、检测结果 组大鼠血清中 、的表达水平较 组显著升高，差异有统计学意义（）。各治疗组 、表达水平较模型组均有不同程度
14、的降低，其中组降低最为明显，差异有统计学意义（）。各 治 疗 组 血 清 、无明显差异（），组血清 低于 组，差异有统计学意义（），显著低于 组（），见表及图。膝骨关节囊 、蛋白表达水平检测结果 组大鼠膝骨关节 蛋白表达较 组显著升高（），提示破骨细胞分化。各治疗组 均低于模型组，组、组明显优于 组（）；然而两者的减少骨破坏的机制并不相同，组抑制 表达为主，组则以增强 表达为主，但 各治疗组之间差异无统计学意义（）。蛋白表达检测结果见表及图。中国中医骨伤科杂志 年月第 卷第期表各组大鼠血清中 、表达水平（，）组别 （）（）（）正常组 模型组 ）复方雷公藤外敷剂组 ）雷公藤多苷组 ）扶他林乳胶剂
15、组 ）注：）与正常组相比，；与模型组相比，），）。图各组大鼠血清、表达水平表各组大鼠膝关节囊 、蛋白表达水平（，）组别 正常组 模型组 ）复方雷公藤外敷剂组 ）雷公藤多苷组 扶他林乳胶剂组 ）注：）与正常组相比，；）与模型组相比，。图各组大鼠膝关节囊、蛋白电泳图及各组 水平讨论类风湿关节炎属中医尪痹范畴，病情迁延，致残率高。团队在既往研究的基础上，突破“肾主骨”这一理念，提出湿热瘀为其核心病机，针对活动性类风湿关节炎关节红肿热痛的症状，发挥中医外治优势，创新雷公藤给药途径，研发出“复方雷公藤外敷剂”，用于类风湿关节炎关节肿痛的辅助治疗。复方雷公藤外敷剂围绕湿热瘀的核心病机而设，其中雷公藤祛风除
16、湿、祛瘀通络为君，辅以大黄、芒硝、乳香、没药等清热解毒、活血通痹，共奏清热除湿、化瘀止痛之效。本课题组前期实验研究表明 ，复方雷公藤外敷剂可抑制细胞外调节蛋白激酶（，）通路活化，显著降低 大鼠膝关节血管内皮生长因子（，）和血管生成素（，）的蛋白含量和 表达水平，提示复方雷公藤外敷剂可能通过调节 信号通路，减轻关节炎症。在此基础上，课题组继续采用类风湿关节炎基础研究中技术成熟的 模型 ，进一步探索其防治类风湿关节炎的作用与可能机制。是调节破骨细胞生成、活化的经典信号通路。诱导破骨细胞促进骨破坏，同时表达 基 质 金 属 蛋 白 酶（，），加速软骨降解，被公认为免疫紊乱的生物标志物，炎症介质刺激可诱导 的产生，靶向抑制或调节 可防止类风湿关节炎组织破坏，其中 、在类风湿关节炎成纤维样滑膜（）中表达上调。本实验与现代研究结果一致，组血清 、升高，各治疗组低于 组，其中 组 显著降低，疗效优于 组和 组，提示复方雷公藤外敷剂在类风湿关节炎治疗中抗炎作用突出，并表现出抑制骨破坏的作用。是调节骨吸收和骨形成平衡的杠杆，早期研究认为其是骨量和骨骼完整性的重要决定 ，性因素，这一比例被用作受试药物疗效