1、 ，（）：王倩，魏小萌，万品文，等 、及 通路相关因子在特应性皮炎小鼠模型中的表达 中国皮肤性病学杂志，（）：杨芳芳，尚朋娟 盐酸氨溴索联合常规治疗对新生儿肺炎的支气管黏膜纤毛结构及炎性因子的影响 河北医科大学学报，（）：庄箭波，顾岚，马岩，等经鼻高流量湿化氧疗对新生儿肺炎血清 、水平的影响河北医药，（）：刘倩，闫俊梅人免疫球蛋白联合经鼻高流量湿化氧疗辅助治疗重症新生儿肺炎的临床效果国际免疫学杂志，（）：，（）：田静，惠晓君，张靖，等 基因多态性与新生儿肺炎易感性及血清炎症细胞因子的关系中国现代医学杂志，（）：范旭升，陈杰华氨溴索联合布地奈德混悬液雾化吸入治疗新生儿肺 炎 疗 效 观 察 海
2、南 医 学，（）：，（）：王星果，曲亮，窦套存，等 的表达调控及生物功能研究进展 生命科学，（）：，：，：谢文静，江裕，陈溶微，等 血清 、检验对小儿肺 炎 支 原 体 感 染 的 诊 断 价 值分析 右 江 医 学，（）：王琳，高洁，耿芳脓毒症患儿外周血 、的表达及与预后的关系国际检验医学杂志，（）：梁淳，尹蕾，田伟肺炎支原体肺炎患儿血浆 、水平变化及其与淋巴细胞亚群、炎症因子的关系研究国际检验医学杂志，（）：方旭仙，施忆玫，谢海清肺炎新生儿和健康新生儿血清内皮素与表皮生长因子水平差异及相关性分析中国妇幼保健，（）：，：，（）：石安惠，牟杰重症肺炎患者外周血 、表达情况及与炎症因子的关系热带
3、医学杂志，（）：（收稿日期：修回日期：）短篇论著基于免疫显色法分析 例儿童耐碳青霉烯革兰阴性菌的碳青霉烯酶表型李婵，陈楠天津市儿童医院检验科，天津 摘要：目的对免疫显色法与 检测耐碳青霉烯酶表型的结果进行对比分析；分析 年住院患儿耐碳青霉烯类革兰阴性菌的耐药性，为临床合理使用抗菌药物及控制院内感染提供参考。方法选用 和 全自动微生物质谱检测系统和全自动微生物鉴定仪对肠杆菌科细菌及非发酵菌开展鉴定和药敏试验；收集 年分离的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（）株，非发酵菌 株；选用 和免疫显色法分别检测这 株细菌的耐碳青霉烯酶表型。结果肠杆菌科细菌以 和 表型为主；非发酵菌中，鲍曼不动杆菌以 表型为主，铜
4、绿假单胞菌以 为主。免疫显色法与 法检测结果比较，差异无统计学意义（）。结论本院住院患儿分离的肠杆科细菌和非发酵菌的耐碳青霉烯酶表型有多种，免疫显色法检测结果与 检测结果一致。关键词：免疫显色法；碳青霉烯酶；肠杆菌；非发酵菌；耐药基因；儿童 ：中图法分类号：文章编号：（）文献标志码：革兰阴性菌是医院感染的关键病原菌，大部分具备多重耐药性，在全部内酰胺抗菌药物中，碳青霉烯类抗菌药物的抑菌活力最强。近年来，伴随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛及不合理应用，革兰阴性菌对这种抗菌药物形成了越来越多的耐药性，不断有在儿童或新生儿群体中暴发感染的报道。根据全国细菌耐药监测网（）数据显示，年儿童医院的耐碳青霉烯肺
5、炎克雷伯菌检出率为，高于三级医院的 和二级医院的，同时比 年儿童医院的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌检出率（）增国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，加。同时，耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（）和耐碳青霉烯铜绿假单胞菌（）检出率随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛和不合理使用也日益增多。产生碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药最主要的机制。本研究使用免疫显色法检测了本地区儿童临床分离的耐碳青霉烯革兰阴性菌产生的碳青霉烯酶表型，为临床合理使用抗菌药物提供依据，同时采用 检测对免疫显色法检测的结果进行验证，以明确此方法的准确性。材料与方法材料收集 年从本院住院患儿临床标本中分离得到的对亚胺培南或美罗培南耐药的肠杆菌
6、科细菌（共 株，其中肺炎克雷伯菌 株、大肠埃希菌 株）和非发酵菌（共 株，其中鲍曼不动杆菌 株、铜绿假单胞菌 株），去除同一患者的重复菌株。仪器与试剂 、扩增仪购自赛默飞世尔科技有限公司；型与 型碳青霉烯酶免疫显色试剂盒、型碳青霉烯酶免疫显色试剂盒、型碳青霉烯酶免疫显色试剂盒、型碳青霉烯酶免疫显色试剂盒购自北京金山川公司；亚胺培南和美罗培南药敏纸片购自赛默飞世尔科技有限公司。方法细菌的鉴定与药敏试验采用 和 全自动微生物质谱检测系统和全自动微生物鉴定仪对肠杆菌科细菌及非发酵菌各自开展鉴定和药敏试验。选用纸片法（法）核查全自动仪器对亚胺培南和或美罗培南耐药性的检测结果，确定待测菌株对亚胺培南和或
7、美罗培南的耐药性与全自动仪器法检测结果一致，折点参 照 中的规范。检测耐药基因（）待测菌核酸提取：将挑选出的菌株接种于血平板，恒温箱孵育 ，挑单独菌落添加 无菌 搅拌，水浴 ，裂解细菌释放出来，以 离心 ，取上清液检测吸光度（）比值 ，评估 提取质量。将得到的上清液分装，于 保存。（）引物设计及扩增种碳青霉烯酶基因：耐药基因引物序列参考文献，由金唯智生物科技（北京）有限公司合成。引物序列见表。表 引物序列基因名称引物序列（）产物大小（）：续表 引物序列基因名称引物序列（）产物大小（）：免疫显色法检测碳青霉烯酶表型使用免疫显色试剂盒进行检测，严格按说明书进行操作。统计学处理采用 软件进行数据处理
8、。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用检验，为差异有统计学意义。采用 软件分析细菌耐药性。结果耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（）的碳青霉烯酶表型分析 检测耐药基因共检测出 型 株，全部为肺炎克雷伯菌；型 株，包含 株肺 炎 克 雷 伯 菌 和 株 大 肠 埃 希 菌；混 合 型 株，均 为 肺 炎 克 雷 伯 菌；混合型株，均为大肠埃希菌；另有株大肠埃希菌的耐药机制不在检测的种碳青霉烯酶表型范围内。免疫显色法检测碳青霉烯酶表型共检测出 型 株，全部为肺炎克雷伯菌；型 株，分别为 株肺炎克雷伯菌和 株大肠埃希菌；混合型 株，均为肺炎克雷伯菌；型株，确认为大肠埃希菌；另有株大肠埃希菌耐药机制不在检测
9、的种碳青霉烯酶表型范围内。免疫显色法检测碳青霉烯酶表型的效能评估以 检测结果作为金标准，对免疫显色法检测碳青霉烯酶从符合率、灵敏度、特异度等方面进行评估，经检验，两种方法检测碳青霉烯酶主要表型的结果比较差异无统计学意义（），见表。株 用两种方法检测，和 两种表型结果均为阴性。例儿童耐碳青霉烯非发酵菌的碳青霉烯酶表型分析 检测耐药基因 株 检测到种碳青 霉 烯 酶 基 因，分 别 为 型（株）、型（株）、型（株），以 型为主；株 检测到 型 株。免疫显色法检测碳青霉烯酶表型使用免疫显色法 对 碳 青 霉 烯 酶 表 达 阳 性 的 菌 株 进 行 检 测，国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，中检
10、测到 型 株、型株、型株，中检测到 株 型。免疫显色法检测碳青霉烯酶表型的效能评估以 结果为金标准，免疫显色法检测 和 碳青霉烯酶表型的灵敏度、特异度均较高。经检验，两种方法检测的碳青霉烯酶表型结果比较差异无统计学意义（）。见表。表两种方法检测碳青霉烯酶主要表型的比较表型检测方法阳性（）阴性（）灵敏度（）特异度（）符合率（）法 免疫显色法 法 免疫显色法 表两种方法检测碳青霉烯酶主要表型的比较表型检测方法阳性（）阴性（）灵敏度（）特异度（）符合率（）法 免疫显色法 法 免疫显色法 产碳青霉烯酶革兰阴性菌的耐药情况分析 菌株对阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素耐药率较低，而对头孢类抗菌药物的耐药率几乎
11、都在 以上；菌株对阿米卡星、四环素、妥布霉素等耐药率低；对阿米卡星耐药率低，对庆大霉素和妥布霉素耐药率在 左右，见表。表耐碳青霉烯革兰阴性菌的耐药情况（）抗菌药物 氨苄西林 哌拉西林 氨苄西林舒巴坦 哌拉西林他唑巴坦 头孢唑啉 头孢呋辛 头孢他啶 头孢曲松 头孢噻肟 头孢吡肟 头孢替坦 头孢呋辛酯 氨曲南 亚胺培南 美洛培南 阿米卡星 庆大霉素 妥布霉素 环丙沙星 左旋氧氟沙星 莫西沙星 复方磺胺甲噁唑 呋喃妥因 四环素 注：表示该项无数据。产碳青霉烯酶革兰阴性菌的临床分布特征岁的幼儿分离到 的比例明显高于岁的儿童，而非发酵菌（和 ）则主要分离自 岁的儿童（）的临床标本。分离到 的患儿中，男性
12、所占比例高于女性；分离到非发酵菌的患儿中，男性所占比例（）比女性（）略高；分离到 最多的临床标本类型是尿液（），分离到非发酵菌最多的临床标本则是痰液（）。见表。表分离到产碳青霉烯酶革兰阴性菌的感染患儿临床特征及标本来源分析项目 菌株（）和 菌株（）年龄（）（）至岁（）（）岁（）（）岁（）（）性别（）男（）（）女（）（）标本类型（）尿液（）（）痰液（）（）脓液（）（）血液（）（）腹水（）分泌物（）（）脑脊液（）支气管肺泡灌洗液（）国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，讨论铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肠杆菌科细菌多见于自然界、医疗环境中以及皮肤上。它们是目前临床中检出最多的革兰阴性菌，是医院门诊继发
13、感染的关键致病菌，尤其是鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌，可引起全身多个部位的感染，是泛耐药菌中最常见的细菌。革兰阴性菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药性的报道越来越多，对于儿童该类报道的数量也在逐年增多，但大多数是小范围报道。本研究结果显示：中，肺炎克雷伯菌产碳青霉烯 酶 表 型 分 别 为 （）、（）、（），大肠埃希菌产碳青 霉 烯 酶 表 型 则 分 别 为 （）、（）、其他（）。肺炎克雷伯菌以 型（包含与 混合型）为主，与国内某大型儿童医院的 型肺炎克雷 伯菌 的 报道基本一致。大肠 埃 希菌 也 以 型为主，与 型大肠埃希菌的主要流行区域是亚洲大陆的中国和印度的报道一致。但北京地区儿童患者分离的碳
14、青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌是以 和 型金属酶为主。这种碳青霉烯酶类型不同的现象，可能与各地区使用抗菌药物种类不同有关。而 株非发酵菌结果中，株 检测到种碳青霉烯酶基因以 型为主，与王紫琦等 研究的以 型检出为主的结论不同，可能与地区和人群不同相关；株 以 为 主。型 中 带 基因质粒，这种耐药特性将如同其在肠杆菌科细菌一样在铜绿假单胞菌中播散。以 检 测 结果为金标 准，免 疫 显 色 法 检 测 的种主要表型 、与 检测结果比较差异无统计学意义（）。同时，免疫显色法对 株菌非发酵菌的结果也与 检测结果比较差异无统计学意义（）。但有几株菌出现 阳性而免疫显色法阴性，可能是因为菌株中目标耐药基因的
15、表达水平低于免疫显色法试剂的检测低限，而 通过扩增过程可以检测到。综上所述，法与免疫显色法同样可以检测肠杆菌及非发酵菌的碳青霉烯酶耐药基因。综上所述，肠杆菌和非发酵菌碳青霉烯酶耐药基因分型所使用的免疫显色法具有操作简便、报告快速、便于操作、不易污染等特点，而且可用于检测非发酵菌和肠杆菌科细菌，优于其他传统的检测方法，适合基层医疗机构实验室常规开展。但本研究的标本量偏少，需要日后积累更多的菌株后进行大样本量检测和分析，以期为临床个性化用药、及时准确地进行评估提供更多参考。参考文献 赵辉，贾楠，徐茶，等 产 肺炎克雷伯菌引起的新生儿感 染 及 其 同 源 性 检 测 中 华 医 院 感 染 学 杂
16、 志，（）：，：，（）：，：，（）：刘萍，闫雪苗，张坚磊，等 株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因分析山东医药，（）：彭俊华，张媛媛，付藏红，等鲍曼不动杆菌耐药表型及碳青霉烯酶 基因分型现代检验医学杂志，（）：刘婧娴，李媛睿，阿旺穷吉，等分离自儿科患者肺炎克雷伯菌的常见碳青霉烯酶基因检测中国感染与化疗杂志，（）：黄维真，潘新年，张清，等儿童肠杆菌科细菌碳青霉烯类耐药的基因型研究广西医科大学学报，（）：，（）：，（）：，（）：喻华，徐雪松，李敏，等肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识中国感染与化疗杂志，（）：张冀霞，刘颖梅，陈宏斌，等我国产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的基因型及流行病学研究 中华内科杂志，（）：王紫琦，陆学东，蒋利利，等深圳地区耐亚胺培南临床菌株耐药机制及可移动基因元件分析微生物学免疫学进展，（）：陈勇，史利宁，胡毓安，等产 铜绿假单胞菌的耐药分子机制及其临床分布 医学研究生报，（）：（收稿日期：修回日期：）国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，