1、食品工业 2023 年第44卷第 2 期 283 分析检测基于离子色谱法测定乳及乳制品中亚硝酸盐含量张丽芳，张淼怡，刘宇奇，郑百芹，周璇，谷守国*1.唐山市食品药品综合检验检测中心（唐山 063000）；2.河北省农产品质量安全检测工程技术创新中心（唐山 063000）；3.唐山市功能性农产品产业技术研究院（唐山 063000）摘要建立离子色谱法测定乳及乳制品中亚硝酸盐含量。样品以乙腈为蛋白沉淀剂,3.6 mmol/L Na2CO3为淋洗液,流速为0.7 mL/min,经Metrosep A Suup7-250/4.0色谱柱分离,电导检测器分析,外标法定量。结果表明,亚硝酸盐出峰时间14.4
2、min,在0.012.0 g/mL质量浓度内线性关系良好,检出限为0.020.04 mg/kg,定量限为0.040.10 mg/kg,方法的平均回收率为85.4%101.3%,相对标准偏差为1.5%7.1%(n=6)。试验方法简单高效、重复性好、准确度高,可用于乳与乳制品中亚硝酸盐含量的快速定量分析。关键词离子色谱法;亚硝酸盐;乳及乳制品;定量检测Determination of Nitrite in Milk and Dairy Products by Ion ChromatographyZHANG Lifang,ZHANG Miaoyi,LIU Yuqi,ZHENG Baiqin,ZHOU
3、 Xuan,GU Shouguo*1.Tangshan Food and Drug Comprehensive Testing Center(Tangshan 063000);2.Hebei Agricultural Products Quality and Safety testing Innovation Center(Tangshan 063000);3.Tangshan Agricultural Product Quality and Safety Testing Centers(Tangshan 063000)Abstract A method for the determinati
4、on of nitrite in milk and dairy products by ion chromatography was established.The protein in the sample was precipitated by acetonitrile.The eluent was composed of 3.6 mmol/L Na2CO3,and the flow rate was 0.7 mL/min.The analysis was performed on Metrosep A Suup7-250/4.0 separation column,and the con
5、ductivity detector was used for detection.The results showed that the peak time of nitrite was 14.4 min.The standard calibration curve was linear for nitrite in the concentration range of 0.01-2.0 g/mL,the limit of detections were 0.02-0.04 mg/kg,and the limit of quantifications were 0.04-0.1 mg/kg.
6、The recoveries of nitrite from samples spiked at three different concentrations were within 85.4%to 101.3%,and the relative standard deviation was within 1.5%to 7.1%(n=6).This method was simple,efficient,reproducible and accurate.It could be used for rapid quantitative analysis of nitrite content in
7、 milk and dairy products.Keywords ion chromatography;nitrite;milk and dairy products;quantitative detection*通信作者；基金项目：河北省二期现代农业产业技术体系创新团队建设项目（HBCT2018120207），河北省高端人才项目；唐山市科技创新领军人才项目（21130243A）乳及乳制品中含有丰富的蛋白质、脂肪、乳糖、维生素和矿物质等营养元素，在日常饮食中占据越来越重要的地位，其质量安全问题也越来越受到关注。亚硝酸盐广泛存在于土壤、地表水、植物和生物系统中。亚硝酸盐与食品中固有的胺类化合物
8、是产生亚硝胺的前体物质，亚硝胺在动物试验中被证实为致癌物。大量摄入亚硝酸盐可诱导高铁血红蛋白血症，导致组织缺氧1-2。新生婴儿对亚硝酸盐非常敏感，且乳制品摄入量大。奶牛的养殖环境、饲养用水及饲料中亚硝酸盐含量过高，有可能导致牛乳中的亚硝酸盐含量超标3因此对乳品中亚硝酸盐进行安全监控十分必要4。鉴于亚硝酸盐对人体的危害性，各国制定食品中亚硝酸盐的添加量和残留量相关限量。世界卫生组织食品添加物联合专家委员会规定：亚硝酸盐每日摄取安全容许量为00.06 mg/kg5。GB 27622017食品安全国家标准 食品中污染物限量6规定：乳及乳制品中生乳的亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）不得大于0.4 mg/kg；
9、乳粉及特殊膳食用食品（婴幼儿配方食品、婴幼儿谷类辅助食品、孕妇及乳母营养补充食品等）亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）不得大于2 mg/kg。乳制品中亚硝酸盐的常见检测方法有分光光度法、液相色谱法、气相色谱法、流动注射法、离子色谱法和液相色谱-质谱联用法7-10。这些方法存在各自的优缺点，如：分光光度法操作复杂，引入镉污染物，易对环境造成污染；气相色谱法灵敏度不高，不能满足乳制品的限量要求；离子色谱法作为无机阴离子分析技术，具有快速、灵敏、选择性好等优点，但GB 5009.332016食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定11中离子色谱法前处理过程需要过柱，操作复杂，成本高。试验采用离子色谱法测
10、定乳及乳制品中亚硝酸盐含量，通过优化前处理条件和筛选色谱分析参数，旨在建立一种准确、快速、低成本的检测方法，为乳及乳制品中亚硝酸盐的测定研究提供技术支持。食品工业 2023 年第44卷第 2 期 284 分析检测1材料与方法1.1材料与试剂亚硝酸根标准物质（1 000 g/mL，北京北方伟业计量技术研究院）；乙腈（色谱纯，DiKMA）。1.2仪器与设备883 Basic IC plus离子色谱仪（瑞士万通）；PL2002分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；LYNX4000高速低温冷冻离心机（Thermo Scientific）；Gd-16高速均质机（新锐科技）。1.3方法1.3.1样品前处理1
11、.3.1.1液态奶和乳饮料称取20 g样品，精确至0.01 g，至50 mL准确量值的离心管中，加入乙腈定容至50 mL，充分涡旋振荡，静置10 min。样品按10 000 r/min离心10 min。取液体过0.45 m水相滤膜后上机。1.3.1.2奶粉称取5 g样品，精确至0.01 g，至50 mL准确量值的离心管中，用20 mL水复溶，加入乙腈定容至50 mL，充分涡旋振荡，静置10 min。随后，样品按10 000 r/min离心10 min。取液体过0.45 m水相滤膜后上机。1.3.1.3干酪称取2.5 g样品，精确至0.01 g，至50 mL准确量值的离心管中，加入20 mL水，
12、加入数粒陶瓷珠，高速匀浆2 min，超声30 min，取出放置至室温，加乙腈定容至50 mL，充分涡旋振荡，静置10 min。随后，样品按10 000 r/min离心10 min。取液体过0.45 m水相滤膜后上机。1.3.2色谱条件色谱柱Metrosep A Suup7-250/4.0；柱温35；进样量50 L；淋洗液流速0.7 mL/min；淋洗液3.6 mmol/L Na2CO3。1.3.3标准溶液配制1.3.3.1标准储备液精确量取0.1 mL 1 000 g/mL的亚硝酸盐标准溶液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制备成10 g/mL标准储备液。1.3.3.2标准中间液精确量取1
13、.0 mL 10 g/mL标准储备液至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制备成1 g/mL的标准中间液。1.3.3.3标准曲线精密吸取0.1，0.2，0.4，0.8，1.0和2.0 mL标准中间液分别至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，制备成0.01，0.02，0.04，0.08，0.10和0.20 g/mL的标准曲线。1.3.3.4基质匹配标准曲线精密吸取0.1，0.2，0.4，0.8，1.0和2.0 mL标准中间液分别至10 mL容量瓶中，用基质空白提取液定容至刻度，制备成0.01，0.02，0.04，0.08，0.10和0.20 g/mL的基质标准曲线。1.3.4计算公式试样中亚硝酸
14、盐（以NO2-计）含量按式（1）计算。X=（1）CVf1 000m1 000式中：X为试样中亚硝酸盐含量，mg/kg；C为试样中实测亚硝酸盐质量浓度，mg/L；V为试样溶液体积，mL；f为稀释倍数；m为试验质量，g。2结果与讨论2.1前处理方法的选择2.1.1样品沉淀剂的选择乳及乳制品中测定亚硝酸盐去除蛋白和脂肪的沉淀剂种类较多，如乙酸锌+亚铁氰化钾、钨酸钠+硫酸、冰乙酸、冰乙酸+乙腈、三氯乙酸+乙腈、乙醇等。乙酸锌+亚铁氰化钾对于乳制品有很好的蛋白沉淀效果，是液相色谱法和分光光度法常用的沉淀剂，但在离子色谱中这些沉淀试剂会引入大量金属离子，污染色谱柱，降低离子色谱柱效12-13。乙酸沉淀法基
15、线相对较平直，同时亚硝酸根不受乙酸根的影响，但在低体积分数时，亚硝酸盐可能受pH影响加速转化，使回收率偏低。乙醇、乙腈是较为理想的蛋白沉淀剂，试验发现乙醇的沉淀效果比乙腈的沉淀效果差，选择乙腈作为蛋白沉淀剂。有机相与水相的比例会影响蛋白沉淀效果和回收率，比较乙腈与水相的体积比分别为73，64，55，46和37时的沉淀效果和对亚硝酸根回收率的影响，结果见表1。在20 g液态奶或乳制品制备成20 mL液态试样时，加入约30 mL乙腈（V乙腈V水=64），蛋白沉淀效果最理想，未出现分层现象，回收率高，确定为蛋白沉淀的最佳条件。试验以乙腈为沉淀剂，沉淀效果与回收率（回收率98.4%）均优于颜琪等14以
16、11的乙腈-3%乙酸为蛋白沉淀剂（回收率97.3%）。干酪试样在水中的溶解度低，样品经高速均质后超声提取，亚硝酸盐回收率优于试样加入水后直接超声提取。对超声提取时间进行优化，亚硝酸盐回收率随着超声时间的延长而提高，到30 min后，回收率趋于稳定，因此确定超声时间为30 min。表1蛋白沉淀剂的选择指标乙腈与水相体积比7 36 45 54 637NO2-回收率/%85.298.496.695.892.5沉淀效果好好较好较好差食品工业 2023 年第44卷第 2 期 285 分析检测2.1.2分离参数的优化试样经蛋白沉淀后，离心进行分离，以亚硝酸盐的回收率为评价指标，筛选出离心转速与时间，设计因素与水平见表2，所得结果见表3。随着离心转速的提高和时间的延长，蛋白分离效果变好，亚硝酸盐的回收率提高后趋于平稳。结合操作时间综合考虑，选择10 000 r/min、离心时间10 min作为分离参数。表2离心转速和时间对亚硝酸盐回收率的影响试验设计因素A(离心转速)因素BB1(5 min)B2(10 min)B3(15 min)A1(6 000 r/min)A1B1A1B2A1B3A2(8 000