1、 年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 新疆维吾尔自治区杰出青年科学基金项目（）；新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室项目（）通信作者李建光，博士，教授，博士生导师，主要从事天然药物资源的研究与开发，：作者简介 包海燕，硕士研究生，主要从事天然药物研究，：基于网络药理学和实验验证探究黑果小檗花色苷防治 的作用机制包海燕，陈玲，阳莹，李敏，李慧敏，康莹莹，李建光，（新疆医科大学 药学院，新疆 乌鲁木齐；新疆科技学院，新疆 库尔勒）摘要 基于网络药理学、分子对接技术和体外实验验证探究黑果小檗花色苷防治阿尔茨海默病（，）的潜在作用机制。借助数据库和在线平台筛选黑果小檗花色苷活性成分的潜在
2、靶点和 相关作用靶点，运用 数据库和 软件对两者共同靶点进行蛋白相互作用网络构建和拓扑学分析，利用 数据库进行基因本体（）功能注释和京都基因与基因组百科全书（）通路富集分析，对活性成分和 通路相关靶点进行分子对接，然后利用脂多糖诱导 细胞构建 神经炎症模型进行体外实验验证。该研究共筛选出黑果小檗活性成分潜在作用靶点 个，药物疾病共同靶点 个，蛋白蛋白网络互作筛选出 个关键靶点，富集分析得到 个 功能富集条目和 个 通路富集条目；分子对接结果显示活性成分和、和 有较好的结合能力，其中结合能力最强的是锦葵素葡萄糖苷；同时，与模型组比较，不同剂量锦葵素葡萄糖苷在不影响 细胞存活率的情况下，一氧化氮浓
3、度均显著下降；同时锦葵素葡萄糖苷可下调、和 的蛋白表达量。该研究利用网络药理学和实验验证初步揭示了黑果小檗花色苷可通过调控 信号通路，抑制脂多糖诱导的神经炎症反应，达到防治 的作用，为其药效物质基础和作用机制研究提供了理论基础。关键词 黑果小檗；花色苷；阿尔茨海默病；网络药理学；分子对接；信号通路 ，（，；，）（），.（）（）（）.（）（），（），（），包海燕等：基于网络药理学和实验验证探究黑果小檗花色苷防治 的作用机制（），（），；：.阿尔茨海默病（，）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。据报道，年全球有约超过 万的痴呆患者，到 年，这一数字可能会增加到.亿。是痴呆症最常见的病因
4、，占所有病因的 ，最新流行病学调查显示，目前我国约有 万的 患者，岁及以上的老人 的患病率为.，正逐渐成为一种持续增长的全球性的疾病。但其发病机制尚未完全阐明，因此，探究 可能的发病机制和潜在的治疗方法成为近年来研究的热点和重点。黑果小檗 别名刺黄檗，为小檗科小檗属落叶灌木，在新疆分布广泛，其干燥果实具有增强食欲、清热解毒、抗菌消炎等功效。黑果小檗果实中含有丰富的花色苷（）成分，花色苷为类黄酮类衍生物，属于植物体内的次生代谢产物，也是自然界最为重要的水溶性色素之一。花色苷具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、改善胰岛素抵抗、防治心血管系统疾病和保护视力等多种作用，花色苷还可以防治神经退行性疾病，改善 的
5、认知功能障碍。课题组前期研究发现，黑果小檗花色苷对 具有一定的防治作用。本研究将继续深入开展黑果小檗花色苷防治 的活性成分和作用机制研究，以期将其开发成为防治 的药物。中医学具有 多年的天然药物临床使用经验，在疾病预防和治疗方面具有独特的优势。中医的“整体”特征催生了以“网络”和“系统”为特征的新一代研究范式，网络药理学作为其代表性的研究领域，为人工智能与医学的跨学科研究、海量生物医学数据的分析、从数据到知识的转变提供了新思路和新方法。网络药理学是一门基于构建疾病表型基因药物多层网络的新兴学科，以整体视角预测药物靶点，提高药物发现效率。本研究利用网络药理学方法，预测黑果小檗花色苷（，）防治 的
6、潜在作用机制，通过分子对接技术和体外细胞实验进一步探究黑果小檗花色苷基于 通路防治 的作用机制，为黑果小檗花色苷后续的实验研究和临床应用提供参考依据。资料和方法.活性成分靶点获取及靶网络图的构建 课题组前期从黑果小檗中发现花色苷和其代谢物活性成分 种，利用 数据库（：）得到活性成分的 字符串和 格式文件，借助 （：）和（：）数据库预测活性成分对应的潜在作用靶点，并通过.软件，构建“药物活性成分靶点”网络图。.疾病相关靶点及药物疾病共同靶点获取利用疾病数据库（：）、（：）、（：）、（：）和（：）数据库，以“”为检索词条，对 的靶点进行检索收集，获取 相关作用靶点。将.项获得的 活性成分靶点与 疾
7、病靶点导入.在线工具绘制 图，获得 共同靶点。.蛋白蛋白相互作用（）网络构建及可视化将 共同靶点导入 数据库（：）进行分析，设置置信度.，隐藏网络中断开的节点，结果保存为 格式文件并导入 .软件中，运用“年 月第 卷第 期.，.，”的功能对 结果进行网络拓扑学分析，构 建 蛋 白蛋 白 互 作 网 络，利 用.软件中的插件 进行关键靶点的筛选。网络中，节点表示分子物种，节点之间的连接的边表示分子间相互作用；节点度值表示与节点相连边的数量，其值越大，即与其相连的节点就越多，表明该节点在网络中越重要，在整个网络中起到枢纽的作用，可能是关键靶点。.生物功能和 通路富集分析基于 .数据库（：）对交集靶
8、点进行基因本体（，）功能注释和京都基因与基因组百科全书（，）通路富集分析。利用微生信（：）在 线 平 台 和 （：）在线作图工具对 和 通路富集结果进行可视化分析。.“药物活性成分靶点疾病通路”网络构建将 活性成分、前 条 通路及其涉及的靶点数据整合，导入 .软件中构建“药物活性成分靶点疾病通路”网络图。.“活性成分靶点”分子对接验证根据 通路富集结果，将相关通路涉及靶点与 活性成分进行分子对接。利用 数据库和 软件得到活性成分的格式文件，从 数据库（：）下载核心靶点的 结构，运用 软件对蛋白质进行去水、加氢等操作，保存为 格式，再经过 .软件和 .软件进行分子对接，通过两者结合能来评价其结合
9、活性。分别选取各蛋白中与 活性成分结合能最小的对接模式，利用 软件进行作图分析。.黑果小檗花色苷防治 体外实验验证.细胞 小鼠小胶质 细胞购自于武汉普诺赛生命科技有限公司。.药物与主要试剂锦葵素葡萄糖苷（，）（成都麦德生科技有限公司，批号）；脂多糖（，）（美国 公司，批号）；一氧化氮（，）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号）；细胞增殖与活性检测（，）试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号）；南美胎牛血清（美国 公司，批号）；高糖培养基、.胰蛋白酶、磷酸盐（）缓冲液（公司，批号分别为.、.、.）；高效 组织 细胞裂解液、蛋白磷酸酶抑制剂混合物（，）、蛋白上样缓冲液、蛋白浓度测定试剂盒
10、（北京索莱宝科技有限 公 司，批 号 分 别 为、）；凝胶快速制备制剂盒、三色预染蛋白（北京博泰斯生物技术有限公司，批号分别为、）；化学发光试剂（美国 公司，批号）；肌动蛋白（）抗体（天津博士德生物技术有限公司，批号）；核因子（，）抗体、髓样细胞分化因子（，）抗体（美国 公司，批号为、）；抗体、样受体（，）抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为、）；核因子 抑制蛋白（，）抗体、抗体、二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔（美国 ，批号分别为、）。.仪器 型 细胞培养箱（美国 科技公司）；型全自动酶标仪（美国 科技公司）；型摇床（美国 公司）；型离心机（美国 公司）；型荧光倒置显微镜（厦门麦克迪奥
11、实业集团有限公司）；型涡旋仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；型电泳仪（美国 公司）；型化学发光凝胶成像系统（美国 公司）。.神经炎症模型构建及实验分组使用 高糖完全培养基（含 胎牛血清和 青链霉素双抗），在 、细胞培养箱中对 细胞培养。用质量浓度为 的 作用于 细胞 构建 神经炎症模型。选取 安全用药范围内的浓度、作为干预组作用浓度。实验分为空白组（培养液）、模型组（培养液）、干包海燕等：基于网络药理学和实验验证探究黑果小檗花色苷防治 的作用机制预组（、培养液作用 培养液）。.法检测细胞存活率取对数生长期的 细胞，以每孔 个细胞密度接种于 孔板，按照实验分组方法干预，培养 后，弃去上清，按
12、照 法加入含 的 培养基，孵育 后，使用酶标仪在 下测定吸光度，计算细胞存活率。.法检测细胞一氧化氮水平取对数生长期的 细胞，以每孔 个细胞密度接种于 孔板，按照实验分组方法干预 ，收集细胞上清液，离心取上清液作为检测样品。按照一氧化氮试剂盒说明书中的 法测定各组细胞释放 的浓度。.蛋白免疫印迹（）法检测相关蛋白表达情况 按照实验分组方法对细胞进行干预，用 裂解液提取细胞蛋白样本，并按照 试剂盒方法进行含量测定，经过制备 凝胶、上样、电泳、电转、脱脂奶粉封闭 后，一抗（、和 抗体）孵育过夜，二抗室温孵育 后，用 发光试剂盒显色，将凝胶成像系统曝光的蛋白条带结果用 进行灰度值分析，以 为内参。.
13、统计学分析采用 .软件进行统计学数据分析，数据用?表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐采用最小显著性查依法（）；若方差不齐使用 事后检验法分析。.表示差异有统计学意义。结果.活性成分潜在作用靶点获取 活性成分共有 种，包括 种 和 种 主要代谢物，见表。通过 数据库、平台和 数据库，对 种活性成分进行靶点预测，筛选结果合并去重后，共获得 个 活性成分潜在作用靶点。表 活性成分信息 活性成分英文名称相对分子质量飞燕草素葡萄糖苷.矢车菊素葡萄糖苷.矮牵牛素葡萄糖苷.芍药素葡萄糖苷.锦葵素葡萄糖苷.间苯三酚醛.没食子酸.原儿茶酸.甲基没食子酸.香草酸.丁香酸.注：黑果小檗花色苷（图、同）。.
14、“药物活性成分作用靶点”网络图构建将 活性成分和其潜在作用靶点导入 .软件中，构建“药物活性成分作用靶点”网络图，见图。其中红色箭形节点代表药物，橙色圆形节点代表 的活性成分，紫色和粉色菱形节点代表活性成分潜在作用靶点，每条边代表药物与活性成分、活性成分与作用靶点之间的相互作用关系。对靶点网络图进行网络拓扑学分析，共涉及 个节点，条边，其中度值较高的活性成分有锦葵素葡萄糖苷（，）、芍药素葡萄糖苷（，）、飞燕草素葡萄糖苷（，）和矮牵牛素葡萄糖苷（，）。年 月第 卷第 期.，.，图 活性成分作用靶点网络 .潜在作用靶点及疾病药物共同靶点获取通 过、和 数据库，对 靶点进行检索和收集，汇总 个数据库
15、靶点结果，去除重复基因，得到 相关靶点 个，见图。将 与 活性成分的靶点输入 .软件绘制韦恩图，取其交集后获得 共同靶点 个，见图。阿尔茨海默病（图、同）。图 潜在作用靶点 .网络分析及关键靶点获取通过 数据库对 共同靶点进图 活性成分与 的共同靶点 行蛋白蛋白相互作用分析，隐藏 个断开无连接节点（、），共涉及到 个节点和 条边。利用 .软件构建 网络图，见图，其中度值（）越大，节点颜色越深。运用 插件和“”的功能进行拓扑分析，计算出度中心性（，）、中介中心性（，）、紧密中心性（，）的平均值，分别是.、.和.，大于三者均值的靶点共有 个，和 大于 倍均值的靶点共有 个，见图、表。包海燕等：基于
16、网络药理学和实验验证探究黑果小檗花色苷防治 的作用机制图 蛋白蛋白相互作用网络 节点大小和由黄变红程度与度值呈正相关，度值越大，节点越大，节点红色越深。图 网络拓扑分析关键靶点 .和 通路富集分析利用 .数据库对交集靶点进行生物富集分析，得到具有统计学意义（.）的 功能富 集 条 目 条，其 中 生 物 过 程（，）条，分子功能（，）条，细胞组分（，）条。对 富集条目按照 进行排序，越小表示富集程度越高，分别选取、和 中排名前 的条目绘制条形图，见图。通路富集结果显示，个交集靶点共涉及到 条通路，利用 排序绘制排名前 的 通路气泡图，见图。其中 轴代表通路名称，轴代表基因所占比例，气泡面积代表通路富集基因数，气泡颜色代表 的大小，气泡颜色越蓝表示信号通路的显著性就越高。富集结果显示 活性成分对 的防治主要分布在癌症通路、信号通路、样受体信号通路、胰岛素信号通路和 信号通路等，这些通路与细胞的凋亡、增殖、氧化应激以及炎症反应等存在密切关系。.网络图构建利用 .软件构建前 条 通路及其涉及的相关靶点药物活性成分疾病网络图，见图。其中红色三角形节点为疾病名称，深绿色正方形节点为；橙色箭形节点