1、引 用 格 式：，.，（）：，马莉萍，马生龙，李云霞，等基于适配体的荧光生物传感器对 的检测技术研究 甘肃科学学报，（）：，：基于适配体的荧光生物传感器对 的检测技术研究马莉萍，马生龙，李云霞，聂莹莹，左显维，（甘肃省科学院传感技术研究所，甘肃 兰州 ；甘肃省传感器与传感技术重点实验室，甘肃 兰州 ）摘要工业迅速发展所带来的重金属污染，是目前威胁人类健康的重要环境问题之一。是一种毒性强且污染较为普遍的重金属离子，较低浓度 就会对人体造成很大危害。基于核酸适配体错配结合 的原理，以特异性双链核酸染料 为荧光指示探针，构建了新型的无标记核酸适配体荧光生物传感器，建立了一种高灵敏度、快速检测 的方法
2、，实现了 高效检测。在优化条件下，传感器对 的检测线性范围为 ，相关系数（）为，检出限为 。种干扰离子（、）的存在不影响 检测，表明该方法对 检测具有较好的特异性。在自来水样的 加标检测实验中，平均回收率达到，具备分析实际样品的能力。关键词核酸适配体；生物传感器；荧光检测；中图分类号：文献标志码：文章编号：（）汞（）是一种重金属元素，生活中的汞污染主要源自化工、电子、冶金、医药、轻工等行业，浓度低至 时便可产生毒性，长期饮用含有微量 的水会引起蓄积性中毒，严重危害人体的神经系统，因此许多国家及组织都制定了饮用水中 的最高限量标准，发展灵敏度高、选择性好的 检测方法具有重要意义。传统的微量 检测
3、方法有原子吸 收 法、荧光 法、质 谱法和电化学方法等，但这些检测方法对实验人员的技术专业性要求较高且耗时长，且检测设备庞大不便携，无法对突发重金属污染事件做出快速响应。随着重金属污染情况的发展及其严重危害性的不断显现，除了要从源头避免重金属污染，发展快速、便携、低成本的重金属检测技术也显得尤为重要。随着各学科的不断发展，检测技术也逐渐变得多元化，学科间的相互结合逐渐被应用到检测中。如利用生物酶、核酸适配体、抗原抗体构建的生物传感器，均成功实现了水中 的检测。核酸适配体是通过 技术从随机的寡核苷酸库中筛选得到的寡核苷酸单链，由 个核苷酸组成。与传统的抗原抗体相比，核酸适配体不仅具有良好的亲和性
4、和选择性，而且易于化学合成和功能化修饰，为构建新型传感器提供了新的思路和平台。目前核酸适配体技术已经广泛应用于核酸、蛋白质、金属离子检测、靶向和生物成像 等相关领域。有研究表明，与胸腺嘧啶（）共价结合形成稳定的 配位结构 ，结构的发现为深入研究 检测技术提供了新的思路。基于这种特殊的 配位作用，科研工作者们发展了多种新型生物传感器以用于 高灵敏度和特异性的检测，其中包括电化学生物传感器 、荧光生物传感器 、光纤生物传感器 等。这些方法都具有便捷、高灵敏、低成本等显著优点，在 快速检测中被广泛应用。第 卷第期 年月 甘 肃 科 学 学 报 收稿日期：；修回日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）
5、；兰州市城关区科技计划项目（）作者简介：马莉萍（），女，甘肃临夏人，硕士，副研究员，研究方向为生物传感技术。：研究利用 与 形成 结构这一特性，采用无标记的适配体荧光生物传感器检测。该方法操作简便，并为 的快速、高灵敏检测提供了新思路。实验材料（）试剂 适配体链 （），适配 体 互 补 链 （）均由上海生工生物科技有限公司合成。荧光染料 （），购自北京美莱博医学有限公司。汞标准溶液，购自北京北方伟业计量技术研究院。、均 购 自 美 国 公司，实验用水为超纯水。核苷酸储备液和缓冲溶液在使用前均在 冰箱储藏柜中保存，所有溶液和缓冲液均用超纯水配制。溶液：将 用 缓冲液（，值）溶液稀释至 作为储存液
6、，下避光保存。再用超纯水将其逐级稀释为 溶液备用。溶液：取 单元素溶液标准物质（），用超纯水稀释定容至，即得 溶液作为储备液，后续根据实验需求进行稀释。（）仪器 荧光光谱仪（爱丁堡公司，英国）；计（上海仪电科学仪器，上海）；离心机（湘仪，湖南）；超纯水：，。检测原理 是 高 灵 敏 的 核 酸 荧 光 染 料，其 与 双 链（）的亲和力非常高，结合 后荧光会显著增强，其与 结合时发出的荧光强度是其与单链 （）结合时荧光强度的 倍，并且荧光信号稳定，不会明显受到 值、温度及作用时间等因素的影响。据此，实验设计了一种基于 和适配体技术的新型荧光生物传感器，其检测 的原理如图所示。由图可知，当体系中
7、没有 时，适配体 与其特异的互补链 杂交形成双链结构，加入 后发出较强荧光；当体系中存在 时，适配体 能被 竞争结合形成复配结构，的构象由无规则卷曲状态到发卡结构，随后加入适配体互补链 和 ，由于 不能和 杂交形成双链，导致荧光值低。因此，荧光强度与 的浓度呈负相关，通过测量 的荧光值强度的变化可定量分析 浓度。图适配体荧光传感器对 的检测原理 实验方法（）荧光发射光谱表征分别考察在 体系和 体系下加入不同浓度 的荧光强度。（）适配体生物传感器 用量研究取 浓度为 的 与等体积浓度为 的 避光反应 ，随后加入不同体积的 荧光染料，避光反应 。最后加入超纯水定容至 ，进行荧光测量。（）的定量检测
8、在最优实验条件下，取 浓度为 的 与不同浓度（、，、）的 溶液反应，避光反应 ，然后加 入 浓 度 为 的 和 的避光反应 ，最后加入超纯水定容至 ，对照组不加 ，进行荧光检测，建立 检测标准曲线。（）特异性研究保持优化好的反应条件不变，分 别 以 、等金属离子替代 ，检测各金属离子的荧光强度，以相同浓度 荧光强度为对照，考察该传感器对 检测的特异性。（）的 加标 回收试 验用 自 来 水 配 制 不同浓度梯度的 样品溶液，检测加入 后自来水样品的荧光强度，检测结果与标准曲线的荧光值进行对比，计算样品加标回收率。（）荧光测量荧光光谱测量条件为：激发波长和发射波长分别为：、，狭缝宽度为第 卷马莉
9、萍等：基于适配体的荧光生物传感器对 的检测技术研究，扫描范围 。上述所有实验均在室温下进行。结果与讨论荧光发射光谱表征为验证该实验设计的合理性，考察了各体系的荧光信号，荧光强度检测如图所示。图中曲线为体系中只存在 ，荧光信号非常弱；曲线 为体系中没有 存在，适配体 与其互补链 结合形成双螺旋结构，加入 后，与 结合，荧光信号迅速增强；曲线、为 体 系 中 分 别 加 入 和 ，能竞争结合在 上形成复合体，阻碍了 与其互补链的杂交，此时在体系中加入适配体互补链 和 后，随着 浓度的增加荧光强度逐渐减小。这表明 能够与本次实验设计的 结合，形成局部配位结构，减弱了适配体与其互补链之间的结合，导致形
10、成的双链 减少，从而使体系的荧光强度变弱，并且随着加入的 浓度越高，荧光强度越弱，证明了检测 的可行性。图荧光发射光谱表征 检测条件的优化（）适配体生物传感器 用量研究 荧光染料用量的优化结果如图所示。由图可知，在适配体及其互补链浓度恒定不变的情况下，加入不同体积的 荧光染料，随着 加入量的增加，荧光强度也不断增加，当加入的 时体系荧光强度达到最高，此后，随着 的增加，荧光强度增加较小，因此后续研究选择为最优 量。图 用量与荧光强度变化 （）检测体系 值优化缓冲液 值是决定体系荧光强度的一个重要因素，对检测的灵敏度和重现性具有显著影响。实验分别考察了不同 值的 缓冲溶液对 检测荧光强度的影响（
11、见图），结果表明 值为的 缓冲液检测效果最佳。图不同 值对 荧光检测信号的影响 的定量检测研究了该适配体生物传感器对 检测的线性范围，在最优的实验条件下，向体系中加入不同浓度的 ，荧光强度检测如图所示。随着 浓度的增加，与 结合的适配体 就越多，导致与 互补识别的 减少，因此荧光强度逐渐变弱。在 范围内，浓度与荧光强度比值（）呈线性关系（见图），其线性方程为.，相关系数（）为，的检出限为 。特异性研究为了证实传感器对 检测的特异性，测定甘 肃 科 学 学 报 年第期图不同浓度 的荧光光谱 图荧光信号与 浓度的线性关系 了其他离子的干扰实验。在其他试剂和反应条件不变的条件下，以 作为对照组，向样
12、品溶液中分别加入 、，检测不同金属离子的荧光强度，并与对照组进行比较，结果如图所示。图显示：加入 的体系荧光强度比值（）最小，而加入其他金属离子的体系变化不大，表明传感器图传感器检测 特异性实验结果 对 测定有较好的特异性。样品 加标回收检测为验证该方法在实际样品检测中的可行性，利用该传感器检测自来水样品中 。向自来水样中分别加入不同浓度（、）的 ，对比荧光检测结果与标准曲线的荧光信号，结果见表。由表可知，在自来水样品中 的 回收 率 分别为 、，平均回收率为，结果表明该方法可用于实际样品分析。表自来水中不同浓度 的检测结果 加标量（）测定值（）回收率 结论基于核酸适配体错配结合 的原理，结合
13、特异性双链荧光染料，构建了一种基于 的新型适配体荧光生物传感器，以此建立了高灵敏度、快速、便携的 荧光检测方法。该方法的检测灵敏度可达 ，检测 的线性范围为 。在自来水样的 加标回收检测中，平均回收率达到。与传统的检测方法相比，其具有操作简便、灵敏度高、特异性好的优点，在水体 含量的检测中具有较好的应用前景。参考文献：中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会生活饮用水卫生标准：北京：中国标准出版社，：，（）：，（）：，第 卷马莉萍等：基于适配体的荧光生物传感器对 的检测技术研究 ，（）：，（）：，（）：，（）：，“”，：，（）：，（）：，（）（）（）：（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（.，；.，），（）（下转第 页）甘 肃 科 学 学 报 年第期社，黄少鹏全球大地热流岩石生热率关系综合分析地球物理学报，（增刊）：任自强，吴基文，彭涛，等 基于自然伽马测井的淮南煤田朱集井田煤系岩浆岩生热率研究煤田地质与勘探，（）：，胡圣标，黄少鹏，何丽娟，等中国大陆地区岩石圈热结构与地热资源潜力 地质学报，（增刊）：，（.，；.，），（），；（本文责编：冯婷）（上接第 页），；（本文责编：毛鸿艳）甘 肃 科 学 学 报 年第期