1、论著甲、乙型流感病毒两种方法检测结果的一致性分析朱旻，曹国君，许育，陈瑜，陈虹，武媚，邢志芳，宋晓冬 复旦大学附属华山医院检验医学科，上海 ；中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，江苏苏州 ；复旦大学附属华山医院儿科，上海 摘要：目的将胶体金免疫层析（以下简称胶体金）法和实时荧光定量聚合酶链反应（）法同时用于甲、乙型流感病毒的检测，比较两种检测方法结果的一致性，并初步评估外周血感染相关指标水平变化对于甲、乙型流感临床诊断的价值。方法收集 年 月日至 年月 日至复旦大学附属华山医院就诊的流感疑似患者的口咽拭子标本 例，所有受试者均被同时采集双份口咽拭子，分别用胶体金法和 法同步进行检测，比较两种
2、检测方法结果的一致性。采用测序法对检测结果进行验证，并根据测序法的检测结果将受试者分为甲型流感病毒阳性组、乙型流感病毒阳性组和阴性组（甲、乙型流感病毒检测均为阴性），比较组受试者外周血感染相关指标水平，评估这些指标对甲、乙型流感临床诊断的价值。结果检出甲型流感病毒阳性 例，检出乙型流感病毒阳性 例，阴性 例。针对甲型流感病毒的检测，法的检测灵敏度和特异度分别为 和 ，胶体金法的检测灵敏度和特异度分别为 和 。针对乙型流感病毒的检测，法检测的灵敏度和特异度分别为 和 ，胶体金法的检测灵敏度和特异度分别为 和 。法与胶体金法的检测结果比较，差异有统计学意义（）。组人群外周血中的反应蛋白和血清淀粉样
3、蛋白水平比较，差异无统计学差异（），阴性组人群外周血白细胞计数、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值和单核细胞绝对值水平较甲型流感病毒阳性组和乙型流感病毒阳性组高，差异有统计学意义（）。针对甲型流感病毒的检测，法与胶体金法检测结果的一致性一般（）；针对乙型流感病毒的检测，法与胶体金法检测结果的一致性差（）。结论将胶体金法、法和外周血感染指标联合应用于流感的诊断，有助于兼顾临床工作中对报告时间与检测结果准确性的要求，提高临床实验室流感的诊断能力。关键词：甲型流感病毒；乙型流感病毒；实时荧光定量聚合酶链反应；胶体金免疫层析；一致性 ：中图法分类号：文章编号：（）文献标志码：，；，；，：（）（），国际检
4、验医学杂志 年月第 卷第期 ，基金项目：上海市科学技术委员会“科技创新行动计划”项目（、）；中国博士后科学基金项目（、）；上海市“医苑新星”青年医学人才培养资助计划青年医学人才类 临床检验项目（沪卫人事 号）。作者简介：朱旻，男，技师，主要从事病原微生物感染的检测研究。通信作者，：。网络首发 ：（），（），（）（），（），（），（），：；流行性感冒病毒是引起全球流行性感冒（以下简称流感）的病原体，主要通过飞沫传播，易感人群为老年人和儿童。流感具有潜伏期短、发病迅速、呈季节性流行的特点。流感患者临床表现常为畏寒、头痛等症状，儿童重症病例可出现休克等并发症。由于流感病毒的高频变异导致流感的精准诊断
5、和疫情防控面临诸多挑战。临床上胶体金免疫层析（以下简称胶体金）法具有操作简便、检测时间短等优点，然而在检测灵敏度和特异度方面存在缺陷，从而可能导致流感的漏诊、误诊。随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（）技术、质谱技术和测序技术等被陆续应用于病毒的检测 。本研究拟将胶体金法和实时荧光定量 （）法同时应用于流感疑似患者标本的检测，初步评估胶体金法和 法在甲、乙型流感病毒检测中的一致性，并评估反应蛋白（）、血清淀粉样蛋白（）和白细胞计数等感染相关指标变化对于甲、乙型流感诊断的价值。资料与方法一般资料将 年 月日至 年月 日于复旦大学附属华山医院就诊的、有流感样症状的流感疑似患者 例纳入研究并收集
6、其口咽拭子标本。男 例、女 例，平均年龄（）岁。流感样症状的定义：（）体温；（）有头痛、咳嗽、喉咙痛、流涕、乏力中的一项症状。本研究获得复旦大学附属华山医院伦理委员会的批准，所有纳入研究者及其监护人均对本研究知情同意。仪器与试剂 型自动核酸提取仪购自德诺杰亿（北京）生物科技有限公司；型全自动医用 分析系统购自上海宏石医疗科技有限公司；甲型乙型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光探针法）购自北京卓诚惠生生物科技有限公司，流感病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）购自标准诊断（韩国）股份有限公司。方法核酸提取与 法检测采用甲型乙型流感病毒核酸检测试剂盒，胶体金法检测采用流感病毒抗原检测试剂盒，具体作步骤和检测结果
7、的判读严格按照试剂盒说明书进行。法检测在内完成检测，胶体金法检测在 内完成。采用测序法对检测结果进行验证，测序法作为结果判断的“金标准”。根据测序结果，将受试者分为甲型流感病毒阳性组、乙型流感病毒阳性组和阴性组（甲、乙型流感病毒检测均为阴性）。检测并比较组人群外周血 、水平及白细胞计数、中性粒细胞绝对值、淋国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，巴细胞绝对值、单核细胞绝对值。统计学处理采用 软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用检验，进一步两两比较采用 检验。计数资料以例数表示，法与胶体金法检测结果的比较采用检验（精确检验）。通过 值评估两种检测方法检测结果的一致性，提示两种
8、检测方法的结果一致性好，提示一致性一般，提示一致性差。为差异有统计学意义。结果临床标本的检测情况及与测序法检测结果的一致性分析 法检出甲型流感病毒阳性 例（），乙型流感病毒阳性 例（）；胶体金法检测出甲型流感病毒阳性 例（），乙型流感病毒阳性 例（）。将标本送第三方公司测序，测序法检出甲型流感病毒阳性 例（），乙型流感病毒阳性 例（），阴性 例（），见表、。以测序法检测结果作为“金标准”，针对甲型流感病毒的检测，法的检测灵敏度、特异度、阳 性 预 测 值、阴 性 预 测 值 分 别 为 、和 ，与测序法检测结果一致性为 （）；胶体金法的检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为 、和 ，
9、与测序法检测结果一致性为 （）。针对乙型流感病毒的检测，法的检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为 、和 ，与测序法检测结果一致性为 （）；胶体金法检测的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为 、和 ，与测序法检测结果的一致性为 （）。法与胶体金法检测结果的一致性分析针对甲型流感病毒的检测，法与胶体金法的检测结果比较，差异有统计学意义（，），两种方法检测结果的一致性一般（）。针对乙型流感病毒的检测，法与胶体金法 的 检 测 结 果 比 较，差 异 有 统 计 学 意 义（，），两种方法检测结果的一致性差（）。见表。感染相关指标的组间比较组人群外周血 和 水 平 比 较，差 异
10、无 统 计 学 差 异（）。白细胞计数、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值和单核细胞绝对值比较，差异均有统计学意义（），阴性组上述项指标水平均高于甲型流感病毒阳性组和乙型流感病毒阳性组（），但乙型流感病毒阳性组与甲型流感病毒阳性组比较，差异均无统计学意义（）。见表。表 法与测序法检测结果的一致性分析（）测序法 法检测甲型流感病毒阳性阴性 法检测乙型流感病毒阳性阴性阳性 阴性 总计 表胶体金法与测序法检测结果的一致性分析（）测序法胶体金法检测甲型流感病毒阳性阴性胶体金法检测乙型流感病毒阳性阴性阳性 阴性 总计 表 法与胶体金法检测结果的一致性分析（）胶体金法 法检测甲型流感病毒阳性阴性 法检测乙型
11、流感病毒阳性阴性阳性 阳性 总计 表组人群外周血标本感染相关指标的比较（）组别 （）（）白细胞计数（）中性粒细胞绝对值（）淋巴细胞绝对值（）单核细胞绝对值（）甲型流感病毒阳性组 乙型流感病毒阳性组 阴性组 注：与阴性组比较，。国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，讨论流感的大流行通常具有暴发突然、传染性强和流行性广等特点，为社会和家庭带来沉重的负担，甚至危及到患者生命安全。对流感进行早期、快速、准确的实验室诊断不仅有助于临床医生尽早地控制患者病情，减少流感相关的死亡事件，减少阴性患者不必要的经验性用药，节约医疗资源，还有助于及时隔离流感患者，切断传染源，早期遏制疫情的蔓延，避免疫情的扩大。流感相
12、关的实验室检测方法多种多样。常见的血常规检测可通过不同功能细胞的数量与形态的变化对患者的病情进行初步评估。和 都是由肝细胞产生的急性时相反应蛋白，当机体发生感染或损伤时其水平会迅速升高，已被临床广泛用作非特异的炎症标志物。水平升高见于细菌感染，病毒及支原体等病原体感染，其水平的升高早于血常规相关炎症指标异常的出现，具有更好的灵敏度。机体内 的水平升高常见于细菌、病毒、真菌和支原体等感染，尤其是多见于病毒感染性疾病，其升高的速度和幅度显著高于 ，可升高数百倍以上，因此 比 反应更灵敏。现有研究已表明，血常规感染相关指标、和 等不同指标的联合检测对于提高流感的实验室诊断率具有重要意义 。白细胞在机
13、体的免疫防御中发挥着重要作用，而流感病毒为了更好地“生存”，可能会通过引起淋巴细胞凋亡和白细胞总数降低等方式抑制机体的免疫。本研究结果显示：与阴性组相比，甲型流感病毒阳性组和乙型流感病毒阳性组白细胞计数、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值均有明显的降低，其对于临床流感的鉴别诊断具有一定的帮助，此结论与陈小桥等 的研究结果基本一致。然而与之前的文献 不同的是：本研究中未发现组间 和 水平差异有统计学意义（），因此某些情况下依靠 和 两个指标并不能很好地区分甲型流感、乙型流感和其他病原体引发的呼吸道感染，流感的准确诊断仍要依赖于更加特异的实验室检测指标。针对流感病毒进行靶向检测的技术
14、包括病毒分离培养法、胶体金法、法、测序法、质谱技术、恒温扩增技术和芯片技术等 ，其中以胶体金法和 法在临床实验室中的应用最为广泛，而测序技术多被用作“金标准”方法。由于测序技术检测成本高、检测周期长、检测通量低而难以被临床实验室广泛应用。本研究发现，针对甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测，胶体金法的检测灵敏度不足 ，而特异度很好，达到了 ；法的灵敏度 达 到 ，特 异 度 达 到 以 上，法所检测到的例甲型流感假阳性和例乙型流感假阳性均为弱阳性，推测并不是真正的假阳性结果，而是由于测序法的检测灵敏度低于 法所致，鉴于本实验的样本量有限，未来的研究中将扩大样本量，对目前的研究结论作进一步的验证。造
15、成胶体金法灵敏度差的主要原因：（）法检测是通过保守区域序列扩增来实现病毒核酸检测的，在流感病毒 和 核酸序列发生变异时对检测结果影响较小，但核酸序列变异会引起病毒抗原漂移，导致抗原检测出现假阴性结果。（）抗原检测受抗原表达情况的限制，感染初期和后期受免疫清除的影响，抗原表达水平低，而核酸可以大量游离于外周血中，因此 检测相比于抗原检测具有更早、灵敏度更高的特点，同时可以对治疗效果进行监测。与 技术相比，胶体金法操作简便、检测成本低、检测速度快、无需辅助设备和专门的实验室，标本随到随检，具有更多的灵活性，能帮助部分病毒载量高的患者就诊当天就可以实现流感的快速、准确诊断，对于患者病情的控制具有重要
16、意义，对于流感疫情的防控工作也具有不可忽略的价值。综上所述，为了实现流感病毒的快速、准确诊断，临床实验室可以采用胶体金法、法和实验室常规感染指标联合使用的策略。多种检测方法的联合使用有助于兼顾临床工作中对报告时间与检测结果准确性的要求，提高实验室诊断率，减少流感的漏诊和误诊。参考文献 国家卫生和计划生育委员会，国家中医药管理局 流行性感冒诊疗方案（年版）中国感染控制杂志，（）：乔鹏，韩雪，王琳上海市杨浦区 年哨点医院儿童流感监测结果 上海预防医学，（）：周慧，武宇辉，于芹，等儿童流感病毒合并革兰阳性菌感染的临床特征及危险因素分析中国小儿急救医学，（）：周倩倩，赵建玉，隋文君，等 甲型流感病毒抗原及核酸检测联合应用研究 中华检验医学杂志，（）：盛鄂湘，陈良君，段勇威，等武汉市流感病毒流行特征及检测方法的比较 国际检验医学杂志，（）：殷荣，张涛，戴鸽，等 例流感病毒肺炎患儿临床特点及重症危险因素分析国际儿科学杂志，（）：张月新探讨实时荧光定量 仪用于流感病毒检测的效果分析中国医疗器械信息，（）：国际检验医学杂志 年月第 卷第期 ，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：于福