1、外排转运蛋白调控其代谢的机制研究 南方医科大学硕士学位论文，付晓春，李少鹏，王敏伟 荭草苷对离体家兔主动脉平滑肌的舒张作用及其机制 中国药科大学学报，（）：赵一静，李银桂，赵忠正，等 异荭草苷调节小胶质细胞活化抑制内毒素血症小鼠神经炎症的研究 中药新药与临床药理，（）：李东辉，王临艳，吴红伟，等 基于分光测色仪探析中药质量 解放军医药杂志，（）：杨兆甜，李方巍，王震昊，等 食品颜色评价及在食品工业中的应用 食品工业科技，（）：干 丽，钟如帆，魏 梅，等 狗脊炮制工艺优选及色度值测定中成药，（）：黄梦婷，潘 玲，邓李红，等 基于 指纹图谱与色度值的桑白皮生品和炮制品的鉴别及炮制终点研究 中国药房
2、，（）：车 欣，于雪冬，郑翔宇，等 我国道地药材适生区研究应用现状 中华中医药学刊，（）：刘娟汝，刘晓梅，刘雨诗，等 基于色度分析原理的青黛有效成分含量与其色度值的相关性分析 中国实验方剂学杂志，（）：高 原，方 妍，单梦瑶，等 基于色差原理分析不同产地桑白皮有效成分含量与颜色的相关性 中国药房，（）：徐曼菲，吴志生，刘晓娜，等 从辨色论质谈中药质量评价方法中国中药杂志，（）：收稿日期：；修订日期：基金项目：河北省中医药管理局科研计划（）作者简介：车开萌（），男（汉族），河北邢台人，河北省中医学院基础医学院在读硕士研究生，主要从事中医医史文献研究工作通讯作者简介：孙士江（），男（满族），河北承
3、德人，河北中医学院第一附属医院教授，硕士学位，主要从事中医医史文献研究、中医养生研究、医院管理工作基于网络药理学与分子对接探析半夏泻心汤治疗肾结石的分子机制车开萌，李定邦，杨 晴，王贺飞，刘 旭，李兆栋，许晓宇，支 政，孙士江（河北中医学院基础医学院，河北 石家庄；河北医科大学公共卫生学院，河北 石家庄；河北中医学院第一附属医院，河北 石家庄）摘要：目的 探讨半夏泻心汤治疗肾结石的网络药理学机制。方法 利用、等数据库，获取半夏泻心汤活性成分与治疗肾结石的交集靶点；使用 对交集靶点进行 富集分析与 通路富集分析；运用 数据库构建交集靶点的蛋白互作网络图；运用 软件构建半夏泻心汤治疗肾结石的药物
4、成分 靶点 疾病网络拓扑图，并进行分析；将半夏泻心汤治疗肾结石的核心成分与核心靶点进行分子对接验证。结果 半夏泻心汤有效成分具有 个治疗肾结石靶点，槲皮素拥有较多治疗靶点，诱导型环加氧酶是主要治疗靶点。治疗靶点富集于 个细胞组分、个生物过程，个分子功能以及 个 通路。分子对接结果显示各核心成分与核心靶点均具有良好的结合力。结论 半夏泻心汤中的槲皮素、山柰酚、汉黄芩素等核心成分可能通过作用于、等核心靶点发挥治疗肾结石的作用。关键词：半夏泻心汤；肾结石；网络药理学；分子对接 标识：中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，；，；，）：，时珍国医国药 年第 卷第 期，：；肾结石（）是泌尿系统的常见
5、病，占泌尿系统结石发病率的 ，好发于青壮年男性，以活动后剧烈腰腹部疼痛、血尿、尿急、尿痛为主要临床表现。肾结石的发病机制尚不明确，目前，主要认为该病是晶体物质在肾脏中异常积累所导致的，例如草酸钙、磷酸胺镁、胱氨酸、尿酸等。西医治疗肾结石的方法较多，其中保守治疗包括服用解痉、抗感染药物等，非保守治疗常用的有体外冲击波碎石、分腔镜手术以及开放性手术等，治疗效果虽然良好，但术后结石残留率与复发率始终居高不下。中医药治疗肾结石具有安全性高、保护肝肾、降低复发率等优势，越来越受到临床的青睐与重视，相关的研究与报道也越来越多。肾结石在祖国医学中归于“石淋”范畴，主要病机为湿热之邪蕴结下焦，肾与膀胱气化不利
6、。牟林茂教授认为，此病注重肾虚为本，湿热为标，疾病发展过程中虚实夹杂，强调合理运用中西医手段，临床注重中药与利尿剂结合使用；赵玉庸教授认为，该病的病机为湿热蕴结或肾气不足，从而导致气化不利，进而形成气滞血瘀，因此临床注重理气与活血；邹燕勤教授认为，气化不利与气滞血瘀恶性循环是结石内阻的重要原因，通调气血、宣达气机有利于祛石和化石，通过宣达三焦、化湿通络从而恢复机体正常气化功能是治疗此病的关键；朱良春教授认为，肾结石的病机为肾虚气化无力、水液代谢失常，杂质日渐沉积形成结石，治疗此病既要谨守下焦湿热蕴结、气滞血瘀的根本病机，又要注重湿热久留，易伤肾气的特征，故新病应清利湿热，通淋化石，久病则需侧重
7、补肾或攻补兼施。由此可见，治疗肾结石多从清利湿热、通利三焦、补肾、理气活血等方向入手，然，黄帝内经载：“脾主身之肌肉”，又载：“脾主运化水谷之精，以生养肌肉，故主肉”，故脾之运化精微营养一身肌肉，从现代医学角度出发，膀胱以及整个尿路存在大量肌肉，肌肉功能紊乱导致肾结石排出不畅，而恢复尿路肌肉功能能够促进可控范围内的结石排出。因此，从脾论治肾结石遵循整体辩证观，揭示疾病发病机理，从而提高临床疗效，降低复发率。半夏泻心汤由半夏、黄芩、黄连、干姜、甘草、人参、大枣 味药共同组成。方中半夏散结除痞、燥湿化痰，为君药；干姜温中散寒，黄芩、黄连苦寒泄热，共为臣药；人参、大枣益气补脾，为佐药；甘草健脾和中，
8、为佐使药，共奏辛开苦降、补泻兼施之功。临床研究表明，半夏泻心汤对于湿热内蕴、寒热互结所致结石有一定疗效，但其治疗机制仍不明晰。网络药理学是一种综合了系统生物学和网络生物学的研究方法，其突破了传统的单一成分 靶点的研究模式，注重从整体上阐明方剂、药物对疾病的治疗机制，是近年来兴起的新研究方法。本研究旨在通过使用网络药理学的研究方法，分析半夏泻心汤治疗肾结石的核心活性成分，预测其作用靶点、作用通路，并利用分子对接方法验证预测结果，以期为进一步实验研究提供理论基础。研究数据库、平台与软件本研究所使用的数据库、平台与软件见表。方法 半半夏夏泻泻心心汤汤活活性性成成分分的的筛筛选选与与靶靶点点预预测测
9、通过检索 数据库，获取半夏泻心汤中各药物的所有化学成分，将得到的结果以口服生物利用度（，）和类药性（，）为阈值，对药物的活性成分进行筛选，同时检索相关文献，补充有效化学成分，最后得出半夏泻心汤的全部活性成分，并利用 数据库预测半夏泻心汤所有活性成分的靶点。再利用 数据库的蛋白基因转换功能，将物种设定为“”，将半夏泻心汤靶点的蛋白质名称转换为基因名称。表 研究所使用数据库、平台与软件序号数据库 软件网址 数据库：数据库：基因信息数据库：数据库：韦恩图网页工具 ：微生信：数据库：疾疾病病靶靶点点筛筛选选 以“”、“”为关键词，在数据库与 数据库中分别进行检索，获取肾结石相关靶点。在 数据库中，值代
10、表靶点与疾病的相关性，分值越高就表明此靶点与肾结石的联系越紧密，利用分值中位数选取相关性强的靶点。将 筛选结果与 数据库检索结果合并去重，获得治疗肾结石潜在靶点。将药物预测靶点与疾病靶点输入 ，获得半夏泻心汤治疗肾结石的交集靶点，并绘制韦恩图。半半夏夏泻泻心心汤汤治治疗疗肾肾结结石石的的网网络络构构建建与与分分析析 将半夏泻心汤的各药物、活性成分以及与肾结石的交集靶点导入 ，构建半夏泻心汤治疗肾结石的“药物 成分 靶点 疾病”网络图，明确半夏泻心汤与肾结石的关系。其中节点（）分别代表了药物、活性成分、治疗靶点，边（）代表了各节点之间的联系。利用 软件的 工具，分析半夏泻心汤活性成分和治疗肾结石
11、靶点以及两者之间的关系，获得各节点的 连 接 度（）、介 度（）和 紧 密 度（），并以这些参数为指标，筛选半夏泻心汤治疗肾结石的核心成分和核心靶点。靶靶点点蛋蛋白白 蛋蛋白白互互作作网网络络 利用在线蛋白相互作用分析数据库（，），检索交集靶点之间的蛋白 蛋白相互关系（，）。在 数据库中选择“”，输入交集靶点，限定物种设为“”，选取交互评分 分的高置信度区间，隐藏游离节点后，获得靶点蛋白互作关系，将其 文件导入 软件并将其可视化，获得靶点 网络图，并分析 值。富富集集分分析析和和 信信号号通通路路分分析析 将交集靶点输入数据库，物种设定为“”，选择个性化分析，对交集靶点分别进行 富集分析和 信
12、号通路富集分析，所得结果利用微生信网站进行绘图。分分子子对对接接验验证证 利用 中所筛选出的结果，分别选择前 位核心成分与核心靶点进行分子对接验证。以核心成分为配体，利用 数据库获得其 格式的分子结构图；以核心靶点为受体，利用 数据库对核心靶点进行检索与结构筛选，从 蛋白数据库获取 格式的蛋白结构，利用 软件去除水分子与残基。应用 为受体添加氢原子，将其改为二级结构，并设置对接参数、调整对接盒子。在 命令中运行 程序，开始分子对接操作，获取最低结合能，并应用 软件构建相互作用模拟图。结果 半半夏夏泻泻心心汤汤药药物物有有效效成成分分筛筛选选与与靶靶点点预预测测 通过检索 时珍国医国药 年第 卷
13、第 期 数据库以及相关文献，获得半夏化学成分 种，黄连 种，黄芩 种，干姜 种，甘草 种，大枣 种，人参 种，通过 筛选条件（，），筛选出半夏泻心汤活性成分共 种，其中 味及以上药物共有的成分 种。部分活性成分信息见表。利用 预测半夏泻心汤各活性成分的靶点，并通过 数据库将靶点名称规范化，最终获得各靶点的基因名称共计 个。表 半夏泻心汤 值前 的活性成分成分名称（）来源 大枣 黄连 黄芩 人参 甘草 大枣 黄连，大枣，甘草 甘草 甘草 甘草 甘草 黄芩 甘草 甘草 甘草，黄芩 大枣 甘草（）（）甘草 疾疾病病靶靶点点筛筛选选结结果果 数据库检索出治疗肾结石的潜在靶点 个，计算 中位数为 ，选取
14、评分大于中位数的靶点共计 个；数据库检索与肾结石相关靶点 个；将两个疾病数据库所获得的靶点进行合并去重，共得到治疗肾结石的潜在靶点 个。将药物预测靶点与疾病靶点取交集，获得半夏泻心汤治疗肾结石的交集靶点 个。利用 绘制韦恩图（），见图。网网络络图图构构建建 利用 构建半夏泻心汤治疗肾结石的药物 成分 靶点 疾病网络图。如图，网络图共 个节点，条边，平均连接度 。图中圆形为药物，菱形为有效成分，矩形为半夏泻心汤治疗肾结石的靶点基因，型为各药物的共有成分。图形的大小与分析所得的 值成正相关，即 值大的图形面积大，值小则图形面积小。按照、综合排列得出核心成分以及核心靶点，其中槲皮素（）、山柰酚（）、
15、汉黄芩素（）、甘草查尔酮（）、异鼠李素（）是分值较高的药物活性成分，诱导型环加氧酶（）、热休克蛋白 （）、雄激素受体（）、雌激素受体（）、结构型环加氧酶（）是分值较高的靶点。详细情况见表。图 半夏泻心汤治疗肾结石韦恩图图 半夏泻心汤治疗肾结石的药物 成分 靶点 疾病图表 半夏泻心汤治疗肾结石的核心靶点与核心成分核心靶点 核心成分 网网络络构构建建 将 个交集靶点上传至 数据库，生成半夏泻心汤治疗肾结石靶点蛋白互作网络图，以连接度大小设置节点大小，并进行排列。从数据库中下载互作网络图的 格式文件，利用 软件对其进行优化，并进行网络拓扑分析。如图，该网络有 个节点，条线，平均 值。图中的节点代表交
16、集靶点，值越大则图形面积越大、颜色越深。其中 值较高的 为、。图 半夏泻心汤治疗肾结石靶点 网络图 富富集集分分析析结结果果 利用 数据库对半夏泻心汤治疗肾结石的 个交集靶点基因进行 功能富集分析与 通路富集分析。功能富集分析结果显示，与交集靶点相关的细胞组分（，）有 个（图），生物过程（，）相关有 个（图），分子功能（，）有 个（图）。通路富集分析结果中，半夏泻心汤治疗肾结石的潜在通路有 条（图）。根据 值，选取前 条绘制气泡图。通过分析结果可知半夏泻心汤治疗肾结石是多个靶点和多条通路共同作用的结果。分分子子对对接接结结果果 将依据药物 成分 靶点 疾病网络拓扑图筛选出的 值排名前 位的活性成分槲皮素、山柰酚与汉黄芩素作为小分子配体，利用前 位的核心靶点、时珍国医国药 年第 卷第 期、作为大分子受体，进行分子对接验证。对接结果见表，模拟对接图见图。研究发现，配体与受体结合越稳定则所需能量越小，结合能小于 提示配体能够与受体自发结合；结合能小于 则表示配体与受体具有较强的结合活性。验证结果显示，各配体与受体的结合能均小于 ，其中汉黄芩素与 的结合能最小，提示半夏泻心汤的核心成分与治疗肾