1、第 1 期第 53 卷基金项目：广西自然科学基金面上基金近江牡蛎 C 型凝集素母源免疫时效及传代机制研究 2020GXNSFAA159088。作者简介：王翠丽（1982），女，助理研究员，博士，主要从事贝类免疫学研究，E-mail：。菌胁迫对近江牡蛎子代母源 C 型凝集素 mRNA 表达及抗菌影响王翠丽1,21.南宁师范大学地理与海洋研究院，广西 南宁 530000；2.南宁师范大学北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室，广西 南宁 530000摘要：为了揭示近江牡蛎（Crassostrea rivularis）C 型凝集素（C-type lectin，CTL）母源免疫在子代胚胎发育早期过程
2、中的免疫防御影响，文章运用荧光定量 PCR、人工促排、免疫相关酶活测定等实验，开展了菌胁迫近江牡蛎子代母源 CTL mRNA 表达及抗菌影响。结果表明：近江牡蛎子代胚胎发育早期可检测到母源 CTL 转录本，母贝分别在不同菌刺激后，其子代在受精卵、32 细胞期、桑葚期、囊胚期 CTL mRNA 相对表达均出现不同程度的升高，与相应空白组比较差异显著（P0.05）；其子代在受精卵期、32 细胞期的 Cu/Zn-SOD 活力和抑菌活性显著高于相应空白组（P0.05）；其子代在原肠胚期、担轮幼虫期累计死亡率均显著低于空白组（P0.05）。结论：该近江牡蛎 CTL 具有母源免疫传代和子代免疫时效，当母源
3、受到适当的免疫刺激可以增加其子代胚胎发育早期对相同病原感染的免疫防御能力。关键词：菌胁迫；近江牡蛎；子代；C 型凝集素；抗菌活力doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.01.028引言近江牡蛎属无 脊椎（Invertebrate）双 壳纲（Bivalvia）动物，缺乏特异性免疫系统，单纯依靠固有免疫系统进行免疫防御，且固有免疫系统成熟较晚，因此在其胚胎发育早期的过程中极易受到细菌、病毒和寄生虫的威胁而导致死亡。目前，虽然在某些养殖动物中实现了通过注射疫苗的方式来增强动物机体的免疫力，提高幼体的成活率，但是在水产养殖动物中不仅普遍使用疫苗存在非常大的困难，而且贝类在自
4、身的免疫系统还未成熟之前使用疫苗也并没有显著的防疫效果。母源免疫是子代免疫系统成熟前的主要免疫防御机制，在个体早期的免疫防御过程中发挥着巨大作用。C 型凝集素是动物凝集素家族的主要成员，对依靠固有免疫系统进行机体免疫防御的双壳贝类具有重大的免疫学意义。C 型凝集素的母源免疫研究现已在脊椎动物鱼类中有了较为全面和深入的研究，但在无脊椎动物中此类研究则显得较为滞后和欠缺。不同于哺乳动物，无脊椎贝类子代继承的母源免疫因子的数量及质量将完全取决于卵子离体之前的积累。目前，无脊椎贝类有关母源免疫因子在子代胚胎中的免疫时效及抑菌活性研究还十分匮乏，还未有关于广西优势经济贝类近江牡蛎的研究报道。综上，本文以
5、近江牡蛎为研究对象，利用多种生物学技术依次开展了母贝不同菌刺激后，对子代胚胎母源 CTL mRNA 相对表达变化、Cu/Zn-SOD 活力、抑菌活性及死亡率的影响；所得结果将揭示近江牡蛎 CTL 母源的免疫传递时效及其在子代中的抑菌效果，能为科学制定近江牡蛎亲本培养技术方案提供可参考基础资料。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物在广西茅尾海养殖区采集成熟期（8 月）近江牡第 53 卷第 1 期2023 年 2 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.1Feb.202389-第 1 期第 53 卷工业微生物蛎成贝样品。肉眼观察性腺发育，拍照记录，挑选活体
6、成贝冷藏、送实验室。1.1.2主要试剂SYBR Select Master Mix 试剂盒，购自 ABI 公司；SOD 活性测定试剂盒（测分型），购自南京建成生物工程研究所有限公司；DEPC 水，购自北京索莱宝科技有限公司；三氯甲烷、异丙醇，购自国药集团；Trizol 试剂，购自 MRC 公司；BCA 蛋白定量检测试剂盒，购自生工生物工程（上海）有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，购自 Invitrogen 公司；TIAN Script RT cDNA 第一链合成试剂盒，购自康为试剂公司等；引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。1.1.3主要仪器体式显微镜（型号为 CX31），购自 Olymp
7、us 公司；T100 梯度热循环仪（型号为 T100TM）、电泳仪（型号为 Powerpac HV 164-5056），购自 Bio-Rad 公司；高速冷冻离心机（型号为 5810R），购自Eppendorf 公司；全自动凝胶成像系统（型号为Syngene Genius），购自 Syngene 公司；超微量紫外分光光度计（型号为 NanoDrop 1000），购自 NanoDrop公司等。1.2方法1.2.1近江牡蛎菌刺激后子代胚胎 CTLmRNA相对表达实验大肠杆菌和金黄色葡萄球菌用 TBS 缓冲液调整浓度均为 OD600=0.5，4 保存备用。采集成熟期（8 月）成贝，若干成贝随机分为 3
8、组，分别为空白组、大肠杆菌实验组和金黄色葡萄球菌实验组；大肠杆菌实验组每只成贝闭壳肌注射上述备用的大肠杆菌悬液 50 L，金黄色葡萄球菌实验组每只成贝闭壳肌注射上述备用的金黄色葡萄球菌悬液 50 L，空白组每只成贝闭壳肌注射 TBS 缓冲液 50 L，注射完成 12 h 后促排卵和人工受精（每组促排卵母贝数量为 6）。受精后的各组子代胚胎分别在受精卵期、32 细胞期、桑葚期、囊胚期、原肠胚期和担轮幼虫期进行取样，并分别放入含 1mL Trizol 溶液的离心管中，标注记录，液氮速冻后在80下保存，用于后续的实验分析。1.2.2总 RNA 提取和反转录实验Trizol 法提取总 RNA，按照 T
9、IAN Script RTcDNA 第一链合成试剂盒的产品说明书进行反转录，反转录样品经过液氮速冻后在80下保存，用于后续的实验分析。1.2.3荧光定量 PCR 分析实验依据 GenBank 数据库所登录 CTL 序列（登录号：MZ411536）和-actin 序列（登录号：AF026063）设计荧光定量 PCR 引物（表 1），7500 FAST 荧光定量 PCR 系统（Applied Bio systems）进行检测分析，GraphPad Prim 5 软件对数据进行差异显著性分析。表 1PCR 引物1.2.4近江牡蛎菌刺激后子代 Cu/Zn-SOD 活力测定实验取上述 1.2.1 空白组
10、、大肠杆菌实验组和金黄色葡萄球菌实验组子代受精卵期、32 细胞期、桑葚期、囊胚期、原肠胚期、担轮幼虫期样品，用预冷 TBS 缓冲液冲洗干净，研钵、研磨棒预冷，胚胎置于研钵中捣碎成均匀混合物，混合物于 4 下 12 000 g 离心15 min，取上清即为总蛋白，用 BCA 法测定总蛋白的浓度，TBS缓冲液调整总蛋白的浓度均为300 g/mL。按照南京建成 SOD 活性测定试剂盒（测分型）说明书测定近江牡蛎子代胚胎在受精卵期、32 细胞期、桑葚期、囊胚期、原肠胚期、担轮幼虫期蛋白提取液的 Cu/Zn-SOD 活性。按以下公式计算 Cu/Zn-SOD活力：Cu/Zn-SOD 活力（U/mg pro
11、t）=（A550nm空白管-A550nm实验管）1.2.5近江牡蛎菌刺激后子代抗菌活性实验取上述 1.2.1 空白组、大肠杆菌实验组和金黄色葡萄球菌实验组胚胎在受精卵期、32 细胞期、桑葚引物名称Primer name引物序列（5-3）Primer sequence（5-3）产物长度（bp）Product length（bp）CTL Real-timePCRForward：5-GCCACCAACCACCACCTCTA-3Reverse：5-CTGCAACAAAGCCTGCCTTT-3176-actin Real-time PCRForward：5-GTGCTACGTTGCCCTGGACTT-3
12、Reverse：5-TCGCTCGTTGCCAATGGTGAT-311590-第 1 期第 53 卷王翠丽：菌胁迫对近江牡蛎子代母源 C 型凝集素 mRNA 表达及抗菌影响期、囊胚期、原肠胚期和担轮幼虫期样品，提取总蛋白并调整其浓度为 300 g/mL，方法同 1.2.4。检测子代蛋白提取液的抗菌活性，大肠杆菌或金黄色葡萄球菌用 TBS 缓冲液调节浓度至 1106个/mL；大肠杆菌或金黄色葡萄球菌实验组，取 60L 蛋白提取液与相应的 20 L 菌悬液于离心管中混匀；在对照组中，取无菌 TBS 缓冲液 60 L 与20 L 菌悬液混匀；空白组中只含有 60 L 蛋白提取液，所有样品于 18下摇
13、床孵育 12 h，取 20 L上述混合液，用无菌 TBS 缓冲液稀释至 200 L，然后取 10 L 涂布在 LB 固体培养基平板上，在 28 下恒温培养。上述方法和下方计算公式参照 Wang等。抗菌活力%=菌落数对照组-(菌落数实验组-菌落数空白组)/菌落数对照组100%1.2.6近江牡蛎菌刺激后子代菌胁迫死亡率测定实验取上述 1.2.1 空白组、大肠杆菌实验组和金黄色葡萄球菌实验组受精卵置于含 1108CFU/L 大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的海水中，受精卵的密度约为 25 个/mL，水温约为 20，充气，每组为 6m2，分别在子代 32 细胞期、桑葚期、囊胚期、原肠胚期和担轮幼虫期取样测每个
14、桶内子代胚胎的密度，并计算死亡率。2结果与分析2.1近江牡蛎菌刺激后子代 CTLmRNA 相对表达结果母贝受到大肠杆菌刺激 12 h 后，子代在受精卵期、32 细胞期、桑葚期中的 CTL mRNA 相对表达量分别是对应空白组子代的约 5 倍、4 倍、3.5 倍，差异极显著（P0.01），子代在囊胚期、原肠胚期中的 CTLmRNA 相对表达量分别是对应空白组子代的约 2倍、1.5 倍，差异显著（P0.05）（图 1A）。母贝受到金黄色葡萄球菌刺激 12 h 后，子代在受精卵期、32 细胞期中的 CTL mRNA 相对表达量分别是对应空白组子代的约 3.5 倍、3 倍，差异极显著（P0.01），子
15、代在桑葚期、囊胚期中的 CTL mRNA 相对表达量分别是对应空白组子代的约 2 倍、1.8 倍，差异显著（P0.05）（图 1B）。2.2近江牡蛎菌刺激后子代 Cu/Zn-SOD 活力和抗菌活性测定结果Cu/Zn-SOD 活力测定结果显示：母贝受到大肠杆菌刺激 12 h 后，实验组子代在受精卵期、32 细胞期、桑葚期中的 Cu/Zn-SOD 活力显著高于空白组注：*表示组间差异极显著（P0.01），*表示组间差异显著（P0.05）图 1母源刺激后子代 C 型凝集素 mRNA 在不同发育期的表达Fertilized egg 32 cellMorulaBlastulaGastrula Troeh
16、ophoreAFertilized egg 32 cellMorulaBlastulaGastrula TroehophoreGroup空白的金黄色葡萄球菌空白的大肠杆菌642043210*BGroup*91-第 1 期第 53 卷工业微生物（P0.05）（图 2A）；抗菌活性测定结果显示：实验组子代在受精卵期、32 细胞期、担轮幼虫期的抗菌活性显著高于空白组（P0.05）（图 2B）。Cu/Zn-SOD 活力测定结果显示：母贝受到金黄色葡萄球菌刺激 12 h 后，实验组子代在受精卵期、32 细胞期中的 Cu/Zn-SOD 活力显著高于空白组子代（P0.05）（图 3A）；抗菌活性测定结果显示：实验组子代在受精卵期、32 细胞期中的抗菌活性显著高于相应空白组（P0.05）（图 3B）。2.3近江牡蛎菌刺激后子代菌胁迫死亡率测定结果死亡率测定结果显示：母贝受到大肠杆菌刺激12 h 后，其子代进行大肠杆菌胁迫，结果显示，子代的死亡率在桑葚期、原肠胚期、担轮幼虫期显著低于空白组（P0.05），子代在担轮幼虫期的累计死亡率平均为 32%，空白组子代平均为 51%，两者比较，差异极显著（P0.0