1、农产品加工2022 年第 12 期摘要：为了提高佛手酵素产品质量，以佛手果为原料，优化具备最佳抗氧化活性酵素的工艺条件。选取酵母菌接种量、发酵时间、糖质量分数和发酵温度为单因素，分析其对酵素液羟基自由基清除率的影响。之后依据单因素试验结果，进行正交试验设计优化制备工艺条件。结果表明，佛手酵素发酵工艺的最佳条件为发酵时间 60 h，糖质量分数 20%，酵母菌接种量（体积比）8%，发酵温度 28。之后，将得到的发酵液灭菌浓缩后通过真空冷冻干燥，制成佛手果渣酵素粉状产品。在此工艺条件下，佛手酵素具备较好的羟基自由基清除活性。关键词：佛手；酵素；抗氧化；优化中图分类号：R284.2文献标志码：Adoi
2、：10.16693/ki.1671-9646（X）.2022.12.033Optimum Preparation of Bergamot Enzyme with Orthogonal DesignQIU Qian1，LIAO Yun1，MENG Qi1，ZHOU Feng1，YAN Yiping1，*ZHANG Hua1，2（1.Chongqing Three Gorges University，College of Biology and Food Engineering，Chongqing 404120，China；2.ChongqingResearch Center of Enginee
3、ring Technology for the Development and Utilization of Unique Biological Resources in NortheastChongqing，Chongqing 404120，China）Abstract：In order to improve the quality of bergamot enzyme products，the experiment used bergamot as raw material to opti-mize the process conditions with the best antioxid
4、ant enzymes.Single factor，including the amount of yeast inoculum，fermen-tation time，sugar concentration and fermentation temperature，was selected to analyze the effects of these factors on the scav-enging rate of hydroxyl radical.Then，according to the single factor test results，the orthogonal test d
5、esign was carried out tooptimize the preparation conditions.The results showed that the optimal fermentation conditions of bergamot were 60 h，20%sugar concentration，8%yeast inoculum（volume ratio）and 28.After that，the obtained fermented liquid was sterilizedand concentrated，and then was dried by vacu
6、um freeze-drying to prepare the fermented powder product of bergamot fruitresidue.The results showed that bergamot enzyme had better scavenging activity of hydroxyl radical.Key words：bergamot；enzyme；antioxidant；optimization抗氧化活性最佳佛手酵素正交法优化制备邱迁1，廖芸1，孟琦1，周锋1，阎怡平1，*张华1，2（1.重庆三峡学院 生物与食品工程学院，重庆404120；2.重
7、庆市渝东北特色生物资源开发利用工程技术研究中心，重庆404120）收稿日期：2022-04-24基金项目：重庆市万州区科技计划项目（WZSTC-2020041）；重庆市技术创新与应用发展专项面上项目（CSTC2020JSCX-KJFPX0011）。作者简介：邱迁（1996），男，在读硕士，研究方向为食品加工与安全。*通讯作者：张华（1982），女，博士，副教授，研究方向为药食同源食品功能成分提取及抗氧化活性分析。佛手属于芸香科柑橘属植物1，是一种药食同源植物，其花、叶、果均可入药，具有疏肝理气、和胃止痛的作用2。食品方面可加工成佛手蜜饯、佛手茶和佛手酒等。佛手主要功能成分包括挥发油、多糖、氨基
8、酸、黄酮类化合物、香橼脂类等化合物3-5。酵素是一种以水果、蔬菜为原材料，利用酵母菌、乳酸菌及其他益生菌发酵而形成的一种液体或固体食物，所含营养成分非常较多，包括脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶等，具有抗炎、抗菌、抗氧化、增强免疫力、降脂、解酒、保肝、美白及改善肠道微环境的功能6-8。由于其天然特性和无副作用而受到人们的广泛追捧。目前，佛手主要通过售卖佛手果和盆景来获得一定的经济效益。与国外相比，我国佛手果深加工产品较少9。因此，试验以佛手为原材料，通过优化试验条件，以羟基自由基清除率为考查指标，研究具有羟基自由基活性最佳佛手酵素制备工艺，为佛手的进一步深加工和开发利用提供理论依据。1材料1.1
9、样本与主要试剂野生新鲜成熟佛手果，外表金黄、皱而有光泽、购自自重庆市万州区龙沙镇。无水乙醇、七水硫酸亚铁、30%过氧化氢溶液，文章编号：1671-9646（2022）12b-0012-04第 12 期（总第 566 期）农产品加工No.122022 年 12 月Farm Products ProcessingDec.2022 年第 12 期中国重庆川东化工集团有限公司提供；水杨酸，成都市科龙化工试剂厂提供；无水葡萄糖，购自当地药店；果胶酶，山东圣斯德食品添加剂有限公司提供；安琪活性干酵母，安琪酵母（伊犁）有限公司提供；红棉纯正红糖，广州市华侨糖厂提供；水为超纯水，实验室自制。1.2主要仪器72
10、2 型可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司产品；FA1004 型号电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品；HH.S 型精密恒温水浴锅，江苏金坛市医疗仪器厂产品；低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；FW80 型高速试样粉碎机，河北省黄市新兴电器厂产品；ZXFD-5250 型十段编程鼓风干燥箱，上海智城分析仪器制造有限公司产品；AIphal1-2 LDplus 型真空冷冻干燥机，德国Christ 公司产品。2试验方法2.1样品预处理将新鲜佛手果切成薄片，置于 60 恒温干燥箱中干燥 4 d，粉碎后过 40 目筛，密封干燥保存。2.2酵母菌的活化准确称安琪活性干酵母粉 5 g 加入质量
11、分数为2%的葡萄糖溶液 50 mL，于 30 条件下进行活化35 h。2.3酵素制备2.3.1工艺流程佛手液的制备（佛手干粉 1 g蒸馏水 20 mL）添加果胶酶反应煮沸糖化灭菌接种酵母菌离心取上清液真空冷冻干燥。2.3.2操作要点准确称取 5 g 过 40 目筛的佛手果干粉，加入蒸馏水,料液比为 120（gmL），之后加入果胶酶0.21 g，作用 15 min 后，煮沸糖化 1.5 h，加入不同量的红糖，摇匀，然后放入灭菌锅，在 115 条件下灭菌 30 min。灭菌冷却后在无菌环境下按不同接种量接种已活化的安琪高活性干酵母，放入恒温箱中进行发酵10。发酵后获得酵素液，并通过测定羟基自由基的
12、活性作为评价酵素功能的检测指标。2.4单因素试验2.4.1酵母菌接种量的确定设定糖质量分数 20%，发酵时间 36 h，发酵温度 30，分别考查不同酵母接种量（体积分数）2%，4%，6%，8%，10%所得酵素的羟基自由基清除率。2.4.2糖质量分数的确定设定发酵时间 36 h，发酵温度 30，酵母接种量 2%，分别考查不同糖质量分数（质量分数）10%，15%，20%，25%，30%所得酵素的羟基自由基的清除率。2.4.3发酵时间的确定设定糖质量分数 20%，发酵温度 30，酵母接种量 2%，分别考查不同发酵时间 36，60，84，108，132 h 所得酵素的羟基自由基清除率。2.4.4发酵温
13、度的确定设定糖质量分数 20%，发酵时间 36 h，酵母接种量 2%，分别考查不同发酵温度 26，28，30，32，34 所得酵素的羟基自由基清除率。2.5正交试验在酵母菌接种量（A）、糖质量分数（B）、发酵时间（C）、发酵温度（D）4 个单因素基础上进行 L9（34）正交试验，设计四因素三水平试验，取 3 个考查水平，分别以发酵时间 36，60，84 h 和糖质量分数10%，15%，20%，酵母菌接种量 4%，6%，8%和发酵温度 28，30，32 对比试验。以所得酵素的羟基自由基的清除率为评价指标，确定酵母菌发酵的最佳工艺条件，每一次试验称取佛手干粉为 5 g。正交试验的因素与水平设计见表
14、 1。2.6测定羟基自由基的清除率2.6.1试剂配制（1）9 mmol/L 乙醇-水杨酸。精确称取水杨酸1.243 g，然后用乙醇溶解，将溶解液移入 100 mL 容量瓶中用乙醇定容，然后取出部分在另一容量瓶中稀释 10 倍。（2）9 mmol/L 硫酸亚铁。精确称取 FeSO4 7H2O溶液 2.502 g，加入蒸馏水溶解，将溶解液移入 100 mL容量瓶中定容，然后取出部分在 10 mL 另一容量瓶中稀释 10 倍。（3）8.8 mmol/L H2O2。精确称取 30%的 H2O2溶液 9.926 g 在小烧杯中，加入蒸馏水，然后移入100 mL 容量瓶中定容，然后取 1 mL 置于另一
15、100 mL容量瓶中稀释 100 倍。2.6.2试验方法取出一支 10 mL 试管，依次加入 9 mmol/L的 FeS-O4溶液 1 mL 和 9 mmol/L 水杨酸溶液 1 mL，再加入稀释后的佛手酵素液 1 mL，最后加入 8.8 mmol/LH2O2溶液 1 mL。充分摇晃均匀后，置于 37 热水中水浴反应 30 min，取出冷却，然后充分摇晃，于510 nm 波长处测定其吸光度为 A1，此为试验组，不加样品为空白组测得的数值为 A，不加 H2O2的为对表 1正交试验的因素与水平设计水平A 发酵时间t/hB 糖质量分数/%123366084101520C 酵母菌接种量/%468D 发
16、酵温度/283032邱迁，等：抗氧化活性最佳佛手酵素正交法优化制备13农产品加工2022 年第 12 期照组，测得的数值为 A011。羟基自由基清除率=A-（A1-A0）A100%.式中：A空白对照的吸光度；A1加样品的吸光度；A0不加显色剂 H2O2。2.7真空冷冻干燥将发酵液可溶性固形物质量分数浓缩到 30%，通过真空冷冻干燥得到水分质量分数小于 5%的佛手果渣酵素粉。真空冷冻干燥条件为冷冻温度-20，真空度 1020 Pa，冷阱温度-45 12。2.8数据统计与分析每组试验设置 3 个重复，数据用 SPSS 18.0 软件进行单因素方差分析，差异显著者进行 Ducans 多重比较。结果用“平均值标准差”表示，显著水平设置为 p=0.05。3结果与分析3.1单因素试验结果3.1.1不同酵母菌接种量对佛手酵素液羟基自由基清除率的影响酵母菌接种量与酵素羟基自由基清除率关系见图 1。由图 1 可知，酵母菌接种量为 6%时，所获得的羟基自由基清除率最大，最高可达到 43.79%。达到最高清除自由基能力之后，随着接种量的增加，羟基自由基清除能力逐渐降低。3.1.2不同糖质量分数对佛手酵素液羟