1、论 著抗体偶联药物维迪西妥单抗对 不同表达水平胃癌细胞抑制效应的体外研究 基金项目：国家自然科学基金资助项目（，）；上海市卫生健康委协同创新集群计划（）上海消化外科研究所 通讯作者，：上海 上海交通大学医学院附属瑞金医院肿瘤科金洋冰，蔡 劬，计 骏，施 敏，张 俊【摘 要】目的 评估抗体偶联药物维迪西妥单抗（）对不同 蛋白表达水平胃癌细胞的体外抑制效应。方法 使用实时荧光定量（）、技术结合细胞免疫荧光共聚焦显微镜，检测胃癌细胞系（、）表达情况及细胞定位。随后对上述不同 表达程度的细胞系分别经不同浓度 处理，技术检测杀伤效应并计算半数抑制浓度（），采用 和 技术检测胃癌细胞经 处理后，不同胃癌细
2、胞株的 及蛋白质表达情况。结果 所检测的胃癌细胞系中，细胞的 表达量最高，其余细胞系均呈 低表达，荧光共聚焦显示 蛋白主要为细胞膜定位。在体外可明显抑制 强阳性胃癌细胞（）增殖，及 的 分别为.及.，该效应呈现明显的剂量依赖性和时间依赖性；而在 低表达胃癌细胞（、）中，同样显示了一定的体外抑制肿瘤细胞增殖的效应，的 分别为.、.、.及.。不论基线时的 蛋白表达高低，经 处理后胃癌细胞的 蛋白表达量均呈明显下降。结论 对体外培养的 不同表达胃癌细胞均显示了抑制增殖的效应，呈时间依赖性和剂量依赖性。作用后可抑制胃癌细胞表面的 蛋白表达，且该效应并不完全依赖于胃癌细胞基线 蛋白表达量的高低。【关键词
3、】胃癌；抗体偶联靶向药物；靶向治疗中图分类号：.文献标识码：文章编号：（），：，：【】（，），（），（）（），（），.，临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，.，.，.，【】；人表皮生长因子受体（）是分子靶向领域的重要信号通路，也是第一个联合化疗应用于晚期胃癌临床实践的明星靶点。属表皮生长因子受体（，）家族成员，通过异二聚体和酪氨酸激酶自身磷酸化介导信号转导，激活 和 等通路，调节肿瘤细胞增殖、分化、凋亡和迁移。作为肿瘤临床转化研究的常用靶点之一，在多种实体瘤靶向治疗中显现出独特优势。约 的晚期胃癌和胃食管交界处腺癌存在 扩增或过表达，且与弥漫型或混合型胃癌相比，阳性更常见于肠型胃癌、染色体不
4、稳定（）亚型胃癌和胃食管交界处腺癌。临床研究（）确立了曲妥珠单抗联合化疗用于晚期 阳性胃癌一线标准治疗的地位。在针对该分子靶点的药物研发方面，除曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和玛格妥昔单抗等单克隆抗体外，酪氨酸激酶抑制剂（拉帕替尼、阿法替尼）、新型双特异性抗体扎尼达单抗（）、转染重组基因的 细胞和单核细胞免疫治疗疫苗（）等新型 靶向药物正逐渐展现出新兴活力，为临床治疗提供了多重选择。抗体偶联靶向药物（，）作为一种新型独特的生物治疗制剂，近年发展迅猛。包含三个关键成分：肿瘤相关单克隆抗体（）、化学连接接头（）及有效载荷（），利用抗原与抗体的高度特异性结合，选择性地将细胞毒性有效载荷内化传递至肿瘤细胞，在
5、提高药物治疗指数的同时，定向杀伤肿瘤细胞。维迪西妥单抗（，）是一种由人源化抗 胞外区单克隆抗体、缬氨酸瓜氨酸（）连接子及细胞毒素单甲基奥瑞他汀（）组合而成的新型抗体偶联靶向药物，相比经 批准的 靶向药物曲妥珠单抗（，.），具有更高亲和效力（，.）。同时可通过抗体部分抑制 激活的下游信号通路，协同细胞毒素药物发挥肿瘤细胞杀伤作用，双重干扰癌细胞的转录、生长、增殖和分裂，发挥抗肿瘤药效。基于在（）临床研究中展示的有效活性及可控安全性，国家药物监督管理局批准该药物用于至少接受过 种系统性化疗的 阳性（）局部晚期或转移性胃癌三线治疗。在疗效预测标志物研究方面，曲妥珠单抗用于晚期胃癌治疗的适用人群为 蛋
6、白免疫组化或者免疫组化 同时 阳性者，上述用于指导单克隆抗体的 判别标准，是否可以直接移植用于指导 类药物的临床决策，除需更多临床数据验证外，还需更多基础研究数据加以支撑。本研究将 暴露于不同 表达水平的人源胃癌细胞系，结合分子生物学和细胞生物学方法，明确 对 不同表达水平胃癌细胞的体外抑制效应，计算半数抑制浓度（），并明确该药物对不同 蛋白表达水平胃癌细胞膜 蛋白的抑制效应差异，为开展后续的体内实验和临床研究提供相关实验基础。材料与方法.细胞系及培养人胃癌细胞系（、）及胃正常上皮细胞 均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，具备 细胞鉴定证书；在添加有 胎牛血清及 青霉素、链霉素的 或
7、培养基中培养，培养箱环境始终保持、，确保细胞状态佳，支原体阴性。待细胞生长至 汇合度，胰蛋白酶消化传代。.试剂与药物 由荣昌生物制药股份有限公司提供；培养基、培养基、胎牛血清及胰蛋白酶均购自美国 公司；临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，、实时光定量 预混液、反转录试剂盒（）及细胞免疫荧光试剂盒购自美国 公司；青霉素链霉素混合液、裂解液、缓冲液及一抗稀释液购自中国上海碧云天生物科技有限公司；蛋白上样缓冲液及 发光液购自中国上海雅酶生物科技有限公司；细胞增殖毒性检测试剂盒（）购自日本同仁化学；一 抗 购 自 美 国 公司；一抗及羊抗兔二抗购自美国 公司。.法检测药物的 取对数生长期细胞制备细胞
8、悬液，以每孔 的细胞密度接种于 孔板培养。细胞黏附过夜，随后暴露于 系列稀释浓度中继续培养 及 。移除培养基后加入 反应试剂，恒温培养箱静置 ，放入酶标仪测定 处的吸光度值。分析实验数据，绘制细胞生长活力曲线及 曲线。按 倍稀释倍数，设置不同药物浓度梯度，探索 对不同胃癌细胞系的 范围。根据预实验结果，分别设置 组不同 药物浓度梯度处理胃癌 细 胞 系（、）及 。其中对 细胞，浓度梯度设置为、.、.、.、.、；对、细胞，浓度梯度设置为、.、.、.、。通过 实验比较 对不同 表达胃癌细胞系的增殖抑制曲线，并计算。.实时荧光定量（）将 作为内参基因，使用 系统测定不同细胞系 基因的 值。使用 提取
9、细胞总 后逆转录成 体系。再配置含有 进行聚合酶链反应，最终计算细胞 基因的相对表达量。实时 引物序列如下：上游引物：，下游引物：；上游引物：，下游引物：。.蛋白质免疫印迹法（）使用 裂解液提取细胞总蛋白，随后通过 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（）分离蛋白质样品并转移至聚偏二氟乙烯膜（）。将经过 牛血清白蛋白（）封闭处理的 膜进行相应浓度一抗 孵育过夜，隔日室温下二抗孵育 。使用 显色法对蛋白样品进行可视化并用 软件对蛋白质条带进行量化标准化。.细胞免疫荧光共聚焦对单层生长细胞进行细胞爬片制作。使用 固定 透化试剂盒制备染色用培养细胞，随后采用 封闭液进行封闭处理。取相应浓度一抗孵育过夜后
10、，二抗室温避光孵育 。对封片进行共聚焦显微镜图像采集。.统计学分析采用 .版软件进行统计学处理。数据以均数标准差表示，两组间的比较采用 检验，多组间比较采用单因素方差分析。以.为差异有统计学意义。结 果.不同胃癌细胞 表达水平的半定量检测检 测 株 胃 癌 细 胞 系（、）及胃正常上皮细 胞 系 的 表达。结果显示，细胞的 蛋白和 表达水平均显著高于其它细胞系，、细胞系的 表达均较弱。见图。：检测 相对表达量；：检测 蛋白表达图 不同胃癌细胞系及胃正常黏膜上皮细胞的 和蛋白表达荧光共聚焦显微镜成像结果显示，株细胞系内 荧光信号表达与蛋白及 表达检测一致，其中 细胞的 荧光信号表达水平显著高于其
11、它细胞系，且 蛋白主要定位于细胞膜。见图。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，染色的 以绿色显示；染色的细胞核以蓝色显示图 细胞免疫荧光共聚焦检测 在胃癌细胞系及胃正常黏膜上皮中的蛋白表达及蛋白定位.对 不同表达水平胃癌细胞系的增殖抑制效应 对 种不同 表达的胃癌细胞系均具有增殖抑制效应，且呈时间和剂量依赖性。其中 细胞对 的处理最敏感，及 的 分别为.及.，且 的 较 大幅降低。见图。在 低表达细胞系（、）中，的抑制效应仍表现为时间和剂量依赖性抑制，且该效应并不完全依赖于细胞 蛋白表达的高低。其中 最低水平表达的 细胞系 及 的 分别为.及.，仅次于 细胞系。、细胞系 的 分别为.、.及.
12、，的 分别为.、.及.。见图。.对人胃癌细胞系 蛋白表达的抑制效应为进一步验证经 处理后胃癌细胞的 表达变化，对不同时间及浓度梯度处理后的 株胃癌细胞分别进行 及 检测。结果显示，处理均显著抑制了胃癌细胞的 表达水平，与体外增殖效应曲线类似，对 蛋白的抑制也呈现一定程度的时间依赖性和剂量依赖性；以对 基线水平呈强阳性的 细胞影响最为显著。见图。讨 论本研 究 结 果 显 示，抗 体 偶 联 药 物 对 蛋白表达的胃癌细胞均显现了一定的体外生长抑制效应，且呈较为明显的时间依赖性和剂量依赖性。对 蛋白高度表达的 细胞 及 的 分别为.及.。同时也发现，在 蛋白表达水平较低的胃癌细胞系中，也显现出抗
13、增殖效应，同样呈一定的时间及剂量依赖性。表达最低的 细胞的 仅次于 细胞，及 的 分别为.及.，提示 蛋白表达水平可能并不是预测 疗效的唯一标志物。此外，因药物可及性的原因，本研究并未纳入 的 及有效载荷做对照，但本课题组以往研究数据显示，单克隆抗体单药在体外培养的肿瘤细胞中，并不显示明显的体外杀伤效应；故作为阳性药物的体外研究，本研究结果显示了 类药物对 阳性胃癌细胞的体外杀伤效应。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，、：经不同时间及不同浓度 处理的 株人胃癌细胞系的细胞存活曲线；、：经不同时间及不同浓度 处理的 株人胃癌细胞系的 曲线图 对 不同表达水平胃癌细胞系的增殖抑制作用 除经由单
14、克隆抗体组分引导 类药物进入肿瘤细胞外，“旁观者杀伤效应”亦可能在上述 低表达胃癌细胞系的抑制中发挥作用；表现为从抗原阳性肿瘤细胞到邻近抗原阴性肿瘤细胞的无意有效载荷扩散。一些药理学特征，例如疏水性有效载荷或可切割接头，也可能在杀伤肿瘤细胞中发挥作用。因此，作为 类药物杀伤肿瘤细胞的机制，可能需要更多维度和方向的探索，一则进一步明确杀伤机制，二则探索更为精准的疗效预测标志物以指导临床决策。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，、：经不同时间及不同浓度 处理后 株人胃癌细胞系 相对水平的改变；、：检测经不同时间及不同浓度 处理后 株人胃癌细胞系 蛋白水平的改变；：.；：.图 的处理对人胃癌细胞系
15、 蛋白表达的抑制作用有关 类药物发挥抗肿瘤作用并不完全依赖其单克隆抗体对应的标靶蛋白表达强度的现象，并非本研究首次发现。（）是另一种由抗 抗体、基于四肽的可切割接头和细胞毒性拓扑异构酶 抑制剂组成的 靶向第 代 代表性药物，临床研究表明 已显示出对（靶向第 代 代表性药物）不敏感的阳性实体瘤及 低表达肿瘤有效的抗肿瘤活性。在 年欧洲肿瘤学年会（）公布的 试验探索性队列结果显示了 在 低表达胃癌（，）中的抗癌活性：接受该 类药物治疗的 例 低表达晚期胃癌中，中位客观缓解率（）为.，中位无进展生存期（）为.个月，从而引发了对 药物目标获益人群和疗效预测标志物 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，
16、的研究浪潮。而 作为第 代，具有较 更强的 抗原抗体亲和力及更强的小分子药物毒性。一项针对 治疗 过表达、局部晚期或转移性胃癌的单臂期临床研究，对 低表达患者（）的纳入，更是凸显出扩大 药物适用人群的临床迫切性。因此初探 在不同 表达水平的胃癌，尤其是在中低表达水平胃癌中的临床疗效，将为现有 靶向 药物的临床应用展开新局面。抗体药物偶联物作为一类新兴的高效靶向药物，是化学疗法和免疫疗法的完美结合。借助各类接头连接特异性 及细胞毒性药物的有效结合，加强肿瘤细胞药物的靶向输送能力，在保护正常细胞的同时，通过旁观者效应扩大药物治疗窗口。尽管如此，已经有越来越多的临床观察对这一范式提出了挑战，肿瘤异质性、药物“旁观者效应”及人体其他组织靶蛋白的表达等，均可能影响 类药物的疗效。类药物中单克隆抗体所针对的标靶蛋白表达程度，可能并不一定是 临床决策的唯一标准，有必要进一步全面研究预测性生物标志物，以协助临床精准决策。综上所述，本项研究基于细胞系的体外实验，表明 不仅可以明确抑制 高表达胃癌细胞系的增殖，同时在 低表达模型中也呈现一定的时间和剂量依赖性的抗增殖潜力，且该抑制效应在 低表达模型中并不完