1、药物检验与分析结核 疫苗宿主蛋白残留检测方法的建立谭奇凤，李 婷，孔雯雯，倪世明，黄 明，梁 艳，吴雪琼，郭润姿（.广州白云山拜迪生物医药有限公司，广东广州；.解放军总医院第八医学中心结核病重点实验室，北京；.固安鼎泰海规生物科技有限公司，河北廊坊）摘要：目的 建立结核 疫苗中大肠杆菌宿主蛋白残留量检测的方法。方法 采用双抗夹心酶联免疫吸附法（法）建立结核 疫苗中宿主蛋白残留量检测的方法，对方法的准确度、专属性、线性范围和耐用性等进行验证，并采用建立的方法对结核 疫苗原液进行测定。结果 大肠杆菌宿主蛋白含量在 范围内，相关系数.，线性关系良好；该法宿主蛋白含量在高中低浓度范围内，回收率在 之内
2、，准确度良好；该法不易受辅料、核酸、孵育温度和孵育时间影响，专属性和耐用性较好；三批原液的宿主蛋白残留量（）均。结论 此方法有较好的准确度、专属性、重复性、中间精密度和耐用性，可用于结核 疫苗的宿主蛋白残留量的检测。关键词：宿主蛋白含量；结核 疫苗；法；检测中图分类号：文献标识码：文章编号：（）作者简介：谭奇凤。职称：制药工程师（中级）。研究方向：生物质量控制。基金项目：国家科技重大专项资助（艾滋病和病毒肝炎等重大传染病的防治，），（.，；.，；.，）：.（），.，.，.（）.，.：；结核病在历史上曾是危害人类的主要杀手之一。据 估算，目前全球结核的潜伏感染人群约 亿，仅 年一年全球新发结核病
3、患者就高达 万。结核病也是我国发病率极高的一种细菌性传染病，其经常发生在贫穷、偏远的社区内或群体中。目前卡介苗是临床应用最广泛且唯一的预防性结核疫苗，然而其对成人肺结核的预防效果并不理想。因此改良现有的粟粒性肺结核卡介苗（.）和开发新型结核疫苗就成了当务之急，其中 疫苗以其安全有效等优点，成为近年来研究的热点之一。疫苗是基因重组技术构建的嵌合型基因质粒，其通过在体内表达抗原等激活机体的免疫系统，从而诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答。新型结核 疫苗是由大肠杆菌发酵、裂解和纯化制备而来，疫苗中的大肠杆菌的 是生产过程由起始原材料工作种子批引入的杂质。虽然在裂解、纯化工艺中大部分 可以被去除，但微量
4、的 仍残留在疫苗制品中。疫苗中的宿主细胞蛋白残留（，）属异源蛋白，临床试验表明，的含量在一定程度上与疫苗接种后的不良反应有较大相关性。可导致多种效应，例如过敏反应、产生抗药抗体和副反应等，因此需要对其残余量进行控制。目前，主要检测方法有、聚丙烯酰胺凝胶电泳（）、高效液相色谱（）、毛细管电泳和质谱法等。灵敏度高，但对结果判定有一定的主观性；法、毛细管电泳和质谱法则需要配备昂贵的仪器或建立专门的分析谱库，因此未被广泛采用；法因其灵敏度高和特异性强得到广泛应用。如何有效地测定新型结核 疫苗中 的残留量是保证产品质量和安全性的重要手段。本文采用 法建立结核 疫苗中宿主蛋白残留含量定量分析的方法并对其进
5、行方法验证。材料与方法.药品、试剂与仪器 结核 疫苗原液（批号，），样品（批号）由广州白云山拜迪生物医药有限公司提供，.试剂盒（批号：，规格：）由武汉基因美生物科技有限公司提供。酶标仪（，）；旋涡混合器（，上海医大仪器有限公司）；电热恒温三用水箱（，广东省汕头市医用设备厂）。.研究对象 结核 疫苗原液。.研究方法.双抗夹心 法：采用双抗夹心法测定标本中大肠杆菌宿主残留蛋白（.）水平。用纯化的大肠杆菌宿主残留蛋白（.）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入大肠杆菌宿主蛋白（.），再与 标记的.抗体结合，形成抗体抗原酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 显色。在 酶的催化下转化成
6、蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中大肠杆菌宿主残留蛋白（.）呈正相关。用酶标仪在 波长下测定吸光度（值），通过标准曲线计算样品中大肠杆菌宿主残留蛋白（.）浓度。.方法学考察.准确度：取同一批原液适量分别加入高、中、低（、）个浓度 标准品，按“.”项下方法测定，各做 个平行样，每个浓度平行检测 次，计算回收率及。.专属性.辅料干扰实验：以 为稀释液稀释标准品，使其浓度为 作为供试品溶液，按“.”项下方法测定，做 个平行样，计算测定结果的。.核酸干扰实：在水中加入结核原液和标准液，使其浓度为 作为供试品溶液，按“.”项下方法测定，做 个平行，计算测定结果的。.重复性：以高、中
7、、低（、）个浓度的 标准液作为供试液，按“.”项下的方法测定，各做 个平行样，每个浓度平行检测 次，计算测定结果的。.中间精密度：以高、中、低（、）个浓度的 标准液作为供试液，由不同人员在不同时间用“.”项下的方法测定供试品 的含量，各做 个平行样，每个浓度平行检测 次，计算测定结果的，分析不同人员的精密度。.线性范围：用标准品稀释液将宿主蛋白标准品（）稀释成 ，不加样品及酶标试剂的孔即为空白对照，上样 ，每个浓度平行测定 个平行样，用 方法测定，测定后以浓度为横坐标，以 个平行样的平均吸光值为纵坐标做回归标准曲线，得出线性方程和相关系数。平行检测 次。.耐用性.不同的实验温度：取同一批结核
8、疫苗原液为供试液，孵育和显色温度为 、和 ，每个条件下做 个平行样，平行检测 次，按“.”项下的方法进行测定并比较同一供试品中 浓度，计算不同条件下测定结果的。.不同的孵育时间：取同一批结核 疫苗原液为供试液，孵育时间为 、和 ，每个条件下做 个平行样，平行检测 次，按“.”项下的方法进行测定并比较同一供试品中 浓度，计算不同条件下测定结果的。结果.准确度 高、中、低（、）个浓度 标准品的 次加标回收率分别为.、.和.，在可接受范围内（），分别为.、.和.，均小于.，该方法准确度较好（见表）。表 准确度实验结果理论值（）回收率（）加标后实测值（）.专属性 辅料干扰实验：以 为稀释液稀释标准品，
9、浓度为 的 个平行样 的平均回收率为.，在 之间，为.，该方法受辅料干扰不大，专属性较好。海峡药学 年 第 卷 第 期核酸干扰实验：在水中加入结核原液和标准液，使其浓度为 作为供试品溶液的 个平行样，的平均回收率为.，在 之间，为.，该方法受核酸干扰不大，专属性较好。.重复性 高浓度（）的标准液实测浓度分别为.、.、.，为.。中浓度（）的标准液实测浓度分别.、.、.，为.。低浓度（）的标准液实测浓度分别.、.、.，为.。测得高、中、低浓度 的含量 均.，该方法重复性较好。.中间精密度 高浓度（）标准液浓度不同人员不同时间 分别为.和.，两人 为.；中浓度（）标准液浓度不同人员不同时间 分别为.
10、和.，两人 为.；低浓度（）标准液浓度不同人员不同时间 分别为.和.，两人 为.。测得高、中、低浓度 的含量不同人员不同时间 均.，该方法中间精密度较好。.线性范围 浓度在 时，浓度与 值呈良好的线性关系，.，为.；.，为.；.，为.，均 .，因此确定该方法的较佳线性范围为 ，检测限为 。.耐用性.不同的实验温度：孵育温度为 与 相比结核 疫苗原液中 含量 为.。与 相比结核 疫苗原液中 含量 为.，均，说明该方法孵育温度控制在 内影响不大。.不同的孵育时间：孵育时间为 与 相比结核 疫苗原液中 含量 为.，孵育温度为 与 相比结核 疫苗原液中 含量 为.，均 。说明该方法孵育时间控制在 内影
11、响不大.待测样品的 残留检测取 批结核 疫苗原液作为供试品，按“.”项方法进行检测，并计算 残留量，各做 个平行样，由结果可知，批样品 残留量均低，符合内控要求。表 批结核 疫苗原液的 结果名称 残留（）（）供试品（）.供试品（）.供试品（）.结论 包括宿主细胞的结构蛋白和宿主细胞分泌的生长因子。按照 指导原则等要求，属于能引起机体的过敏反应等不良反应的有关杂质，需对疫苗中 的残留量进行限度控制，以保证疫苗的安全性。目前国际上普遍采用 法进行 检测，中国药典三部收载的 检测方法也为 法，该法具有较高的灵敏度和特异性等优点，。根据 年版中华人民共和国药典收载的大肠埃希氏菌菌体蛋白质残留量测定法，
12、该法需要自己配制试剂，检验时间长（至少 天），且用邻苯二胺（）显色，毒性较大。本实验室建立的双抗夹心法方便、快速，仅 内即可完成对原液中 的检验且灵敏度高，灵敏度能达到，使用四甲基联苯胺（）显色，毒性较小。同时，根据注册申报和 要求等，在建立药品的关键分析方法需经验证后方可用于放行检测。中华人民共和国药典 药品质量标准分析方法验证指导原则指出，对 法应用于 类创新药新型结核 宿主蛋白残留检测进行系统的适用性验证，其中包括准确度、专属性、线性范围和耐用性等。验证结果表明该法具有较强的特异性，检测限为 ，线性良好.，准确度较好，回收率在 之间；专属性较强，受辅料和核酸干扰小；出于对二抗孵育温度和孵
13、育时间可能会影响最终的 值，从而影响实验结果，因此设计实验对二抗孵育温度和孵育时间进行考察，结果表明该方法耐用性较好，在一定范围内不同孵育温度和孵育时间结果影响较小。另外，采用通过验证的方法对 批结核 疫苗原液进行检测，结果显示原液中的 含量均小于 ，满足质控要求。建立该法之后，有助于公司节约检验时间，降低检验成本。将本法应用于公司其他质粒 疫苗检验中，可以积累大量数据，为日后改良生产工艺提供坚实可靠的数据。当前，残留在精确定量方面面临诸多挑战，一般重组 疫苗中的 残留都以 作为质控标准，而高浓度的药物蛋白很有可能对 的精确定量产生干扰，同时低浓度的 残留要求检测方法的灵敏度需要足够低，。本法
14、检测限为，灵敏度足够低，能精确检测低浓度产品的，既能满足纯化工艺对 去除的研究，也能适用于对新型结核 疫苗的 含量检测，同时为那些国内其它类的 疫苗的 含量测定提供参考。参考文献 .，.：.，：.陶立峰，蒲江.结核病疫苗研究.中国新药杂志，（）：.曹颖，张湘燕，张翊玲，等.结核疫苗研究现状与进展.贵州医药，（）：.童叶青，候双翼，叶建君，等.结核病疫苗研究新发展.中国药师，（）：.，.，：.徐春娥，田晓娟，刘鹤，等.宿主蛋白残留检测及数据分析中存在 .的问题.首都医药，（下）：.罗剑，张敏，周琳婷，等.细胞宿主蛋白含量双抗夹心法 检测方法的建立.微生物学免疫学进展，（）：.张峰，董衍东，郭莎，
15、等.种中国仓鼠卵巢细胞蛋白残留检测试剂盒的比较研究.中国药学杂志，（）：.张峰，秦俭，郭莎，等.宿主细胞蛋白残留量检测方法适用性验证.中国药学杂志，（）：.，.：.，（）：.，.，（）：.王宁，佟雪莲，边静雅，等.昆虫细胞宿主蛋白含量双抗夹心 检测方法的建立.中国生物制品学杂志，（）：.支文标，李巍巍，李士杭，等.补料优化降低生产过程中宿主细胞蛋白残留的研究.现代生物医学进展，（）：.，.，：.，.（）.，（）：.，.，.，（）：.柯志，周冬梅，徐军，等.单抗制品中 细胞宿主蛋白双抗夹心 检测方法的建立.中国生物制品学杂志，（）：.，.，（）：.赵玉秀，梁宏阳，马可，等.鸡胚细胞疫苗制品宿主细
16、胞残留量检测方法的建立.中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会，.，.，（）：.，.（）.，：.，.（）.，（）：.驯化台湾香檬中川陈皮素与辛弗林的鉴别与测定王 杰（福建省亚热带植物研究所，福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建厦门）摘要：目的 建立驯化台湾香檬中川陈皮素与辛弗林的鉴别和测定方法。方法 采用薄层色谱法进行定性鉴别，高效液相色谱法进行含量测定。色谱条件 色谱柱（.，.）；流动相（乙腈）流动相（十二烷基硫酸钠.，冰醋酸，乙腈，加水定容至）等度洗脱；流速为；检测波长（辛弗林）、（川陈皮素）；柱温 。结果 薄层色谱中供试品与对照品相应位置斑点一致。川陈皮素、辛弗林线性范分别为.（.）、.（.）。加样回收率分别为.（.），.（.）。精密度、重现性、稳定性良好。结论 所建立的方法专属性强，灵敏、可靠，可用于川陈皮素与辛弗林的鉴别与测定。关键词：台湾香檬；川陈皮素；辛弗林；薄层色谱法；高效液相色谱法中图分类号：文献标识码：文章编号：（）作者简介：王 杰，男（）。学历：硕士研究生。职称：工程师。从事植物天然产物产品研发。基金项目：厦门市重大科技计划项目（.）（，）海峡药学