1、2023 年 第 4 期 广 东 化 工 第 50 卷 总第 486 期 81 金花茶叶水提物不同极性部位体外抑菌活性研究金花茶叶水提物不同极性部位体外抑菌活性研究 邓书武1,2，叶有芳3，刘雪萍4*，蒋伟哲1*(1广西医科大学药学院，广西 南宁 530021；2广西医科大学第一附属医院药学部，广西 南宁 530021；3北海食品药品检验所，广西 北海 536002；4广西卫生职业技术学院医学基础部，广西 南宁 530023)摘 要目的：研究金花茶叶水提物不同极性部位对白色念珠菌、黑曲霉菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的体外抑菌效果。方法：金花茶叶水提物分别经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取得
2、到不同极性部位，采用滤纸片扩散法、比浊法和绘制抑菌生长曲线进行抑菌活性研究。结果：金花茶叶水提物的水部位对大肠埃希菌在体外有抑菌效果，对白色念珠菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌未发现抑菌效果，其他极性部位均未发现对上述几种菌有抑菌效果。结论：金花茶叶水提物的水部位对大肠埃希菌在体外有抑菌效果。关键词金花茶叶；不同极性部位；抑菌；生长曲线；比浊法；滤纸片扩散法 中图分类号TQ 文献标识码A 文章编号1007-1865(2023)04-0081-03 Antibacterial Study of Camellia Nitidissima Leaves Aqueous Extracts Different
3、 Polarities Deng Shuwu1,2,Ye Youfang3,Liu Xueping4*,Jang Weizhe1*(1.College of Pharmacy,Guangxi Medical University,Nanning 530021；2.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021；3.Beihai Food and Drug Administration,Beihai 536002；4.Department of Ba
4、sic Medicine,Guangxi Medical College,Nanning 530023,China)Abstract:Objective:Study the antibacterial effect on Monilia albican,Aspergillus niger,Escherichia coli and Bacillus subtilis with the different polarities of Camellia nitidissima leaves.Methods:Test the extracts which is extracted by petrole
5、um ether,chloroform,ethyl acetate and n-butanol from Camellia nitidissima leaves aqueous extracts antibacterial effect by using turbidimetry and disc diffusion method,drawing antibacterial growth curve.Results:Only water fractions have antibacterial effect on Escherichia coli,the others were not fou
6、nd have antibacterial effect on the less of the testing microbes.Conclusion:The water fractions of Camellia nitidissima leaves aqueous extracts have antibacterial effect on Escherichia coli.Keywords:Camellia nitidissima leaves；different polarities；antibacteria；growth curve；Turbidimetry；disc diffusio
7、n method 随着抗生素的不合理使用，细菌耐药性逐年上升，已成为全球医学界的难题1。中药在治疗感染性疾病方面有着悠久的历史。中药能延缓甚至逆转细菌耐药，对于抗菌有其独特的优势2。采用中药来抗菌，或许能开辟出一条新的可持续的抗菌道路。金花茶 Camellia nitidissima 是山茶科 Theaceae 山茶属Camellia 的常绿灌木或小乔木，种质珍贵、稀缺，属国家一级保护植物，享有“植物界大熊猫”和“茶族皇后”的美誉3-4。金花茶花瓣如黄金般艳美，极具观赏价值。此外，金花茶富含多种化学物质：黄酮、多糖、皂苷、挥发性成分、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)等5-7，具有广泛的药用价值，
8、其花和叶作为广西壮族民间的传统用药，在民间用于清热解毒、利尿消肿、咽喉炎、痢疾等8。有文献表明金花茶有显著的抑菌效果9，金花茶叶水提物对白色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、绿脓杆菌、乙型链球菌、白喉杆菌效果较好10。本研究通过比较金花茶叶水提物不同极性部位对白色念珠菌、黑曲霉菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的体外抑菌活性，进一步为金花茶叶在抑菌功效上的合理利用提供科学依据，挖掘金花茶的药用价值，同时为提取、分离纯化金花茶叶抑菌成分的研究奠定基础，充分发挥中医药优势，拓展中药抗感染的新思路。1 材料与方法材料与方法 1.1 材料与试剂 金花茶叶：采自广西合浦县康顺金花茶基地，经广西卫生职业技术学院中药学教授
9、刘安韬鉴定为防普金花茶叶。金花茶新鲜叶子自然晾干后粉碎为粗粉，备用。石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇：广东光华科技股份有限公司。菌 种：白 色 念 珠 菌CMCC(F)98001、黑 曲 霉 菌CMCC(F)98003、大肠埃希菌 CMCC(B)44102、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 厂家均为广东环凯微生物科技有限公司。培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液厂家均为北京路桥技术股份有限公司。1.2 主要仪器与设备 生物安全柜：BSC-1600A2 型，苏州安泰空气技术有限公司；隔水式恒温培养箱：GHP
10、-9270 型，上海一恒科学仪器有限公司；721 分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；霉菌培养箱：MJ-150-II 型，上海一恒科学仪器有限公司。1.3 制备金花茶叶水提物不同极性部位 将金花茶叶粗粉用5倍纯化水煎煮提取2次，时间均为1 h，合并提取液，于真空下浓缩至浸膏，称重折算成每克稠膏的生药量，用纯化水稀释，依次经过石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水部位，分别浓缩成浸膏。石油醚未提取得浸膏。1.4 制备菌悬液 接种大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，35 培养 24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中 20
11、培养 2 天。上述培养物用 pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每 l mL 含菌数约为108 cfu11的菌悬液。接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基25 培养 5 天，加入适量含 0.05%(mL/mL)聚山梨酯 80 的pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05%(mL/mL)聚山梨酯 80 的 pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每 1 mL 含孢子数约为 108 cfu的菌悬液。1.5 制备培养基 pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液：称取 9.0 g 于 1 L 纯化水中，加热煮沸溶解，121 高压灭菌 15 min。胰酪大
12、豆胨琼脂培养基：称取 40.0 g 于 1 L 纯化水中，加热煮沸至完全溶解，121 收稿日期 2022-10-30 基金项目 2021 年广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(2021KY1370)作者简介 邓书武(1988-)，男，广西贵港人，在读硕士研究生，主管药师，主要研究方向为药品质量标准研究。*为通讯作者：刘雪萍(1989-)，女，广西合浦人，硕士研究生，讲师，主要研究方向为民族药研究与开发工作。蒋伟哲(1968-)，男，广西河池人，博士，教授，主要研究方向为中药研究与开发工作。广 东 化 工 2023 年 第 4 期 82 第 50 卷 总第 486 期 高压灭菌 15 min
13、。胰酪大豆胨液体培养基：称取 30.0 g 于 1 L纯化水中，加热煮沸溶解，121 高压灭菌 15 min。麦康凯琼脂培养基：称取50.0 g于1 L纯化水中，加热煮沸至完全溶解，121 高压灭菌15 min。沙氏葡萄糖琼脂培养基：称取65.0 g于1 L纯化水中，加热煮沸至完全溶解，115 高压灭菌15 min。1.6 体外抑菌活性测定 1.6.1 测定抑菌效果 采用滤纸片扩散法12测定不同极性部位对不同菌的抑菌效果。用纯化水，按 11 配不同提取物溶液，分别放入直径为 8 mm 的圆形滤纸片，于 121 高压灭菌 20 min 备用。在生物安全柜中每个平皿倒入约 20 mL 培养基，静置
14、冷却凝固。如表 1 在相应的培养基上分别均匀涂布 0.1 mL 菌悬液。沥干含有不同提取物的滤纸，铺在培养基上，按表 1 条件培养。表表 1 不同菌的培养条件不同菌的培养条件 Tab.1 Culture conditions 组别 菌种 培养基 培养温度/培养时间/天 1 白色念珠菌 沙氏葡萄糖琼脂培养基 25 5 2 黑曲霉菌 沙氏葡萄糖琼脂培养基 25 5 3 大肠埃希菌 麦康凯琼脂培养基 35 3 4 枯草芽孢杆菌 胰酪大豆胨琼脂培养基 35 3 1.6.2 测定最低抑菌浓度 通过滤纸片扩散法得知水部位对大肠埃希菌有抑菌效果。本研究采用比浊法13测定最低抑菌浓度，能更好体现对应浓度下的抑
15、菌效果。A 组取 7 支试管加入 0 mg、20 mg、40 mg、60 mg、80 mg、100 mg、120 mg 水部位提取物，每支试管注入 9.9 mL 胰酪大豆胨液体培养基，B 组制配同样的试管。两组试管 121 高压灭菌 20 min。在生物安全柜中于 A 组每支试管分别加入0.1 mL大肠埃希菌菌悬液。B组试管加入0.1 mL pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液作为阴性对照。两组试管在 35 环境下培养 18 h14-15后观察。1.6.3 水部位对大肠埃希菌生长曲线的抑制作用 A组取250 mL三角烧瓶4个，分别用胰酪大豆胨液体培养基100 mL制成含有水部位提取物0 mg/m
16、L(阳性对照组)、4 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL 的溶液，B 组制配同样梯度的溶液。两组烧瓶 121 高压灭菌 20 min。在生物安全柜中 A 组每个三角烧瓶分别加入 0.1 mL 大肠埃希菌菌悬液。B 组各烧瓶加入0.1 mL pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液。两组烧瓶在 35 环境下培养。A 组做为样品，用 B 组相应的浓度作为空白对照，每隔 2 h 测定 OD600 值16-17，重复实验三次，取平均值画生长曲线。2 结果与分析结果与分析 2.1 滤纸片扩散法的测定结果 表表 2 提取物不同部位的抑菌观察提取物不同部位的抑菌观察 Tab.2 Different polarities antibacterial effect 菌种 乙酸乙酯 氯仿 正丁醇 水部位 白色念珠菌-黑曲霉菌-大肠埃希菌-+枯草芽孢杆菌-注：N=3；+表示有明显抑菌圈；-表示无明显抑菌圈 从表 2 知，仅观察到水部位对大肠埃希菌有明显的抑菌圈。说明金花茶叶水提物的水部位对大肠埃希菌在体外有抑菌效果，对白色念珠菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌未发现抑菌效果，其他提取物的极性部位均未发现对上述几