1、试验研究NO.02 202394饲料研究 FEED RESEARCH连翘叶中7种成分的抗氧化活性研究王学方1，2 陈玲1，3 宁二娟1，3 归荣2 王伟1，3 范毅1，3 王学兵2 李晓1，3*（1.河南省纳普生物技术有限公司，河南 郑州 450002；2.河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450000；3.河南省科学院，河南 郑州 450002）摘要：试验旨在筛选出连翘叶抗氧化的主要药效物质，探讨其抗氧化的作用效果。采用化学法、过氧化氢诱导巨噬细胞RAW264.7损伤模型，以清除DPPH自由基、ABTS自由基、O2-自由基和细胞抗氧化酶活力为指标，综合评价连翘叶中7种成分的抗氧化活性。结果
2、显示，连翘叶中连翘酯苷A（FSA）、连翘酯苷B（FSB）、连翘酯苷H（FSH）和连翘酯苷I（FSI）成分对DPPH自由基、ABTS自由基、O2-自由基均具有较好的清除能力。FSA、FSB、FSH 和 FSI 可提高过氧化氢诱导的巨噬细胞 RAW264.7 中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性，提高还原性谷胱甘肽（GSH）含量，降低丙二醛（MDA）含量，改善过氧化氢诱导的细胞氧化损伤。经热图分析及主成分分析，发现FSA、FSB、FSH、FSI 4种苯乙醇苷类成分与抗氧化能力呈正相关。研究表明，连翘叶中的FSA、FSB、FSH、FSI 4种苯乙醇苷类成分具有较好的抗氧化活性，是连翘
3、叶发挥抗氧化活性的主要药效物质。关键词：连翘叶；苯乙醇苷；抗氧化；主成分分析中图分类号：S 816.7 文献标识码：A 文章编号：1002-2813（2023）02-0094-06 Doi：10.13557/ki.issn1002-2813.2023.02.019Study on antioxidant activity of seven components in Forsythia suspensa leavesWANG Xue-fang CHEN Ling NING Er-juan GUI Rong WANG Wei FAN Yi WANG Xue-bing LI XiaoAbstrac
4、t:The experiment was to screen out the main antioxidation substances of Forsythia suspensa leaves and explore its antioxidation effect.The antioxidation activity of seven components in Forsythia suspensa leaves was comprehensively evaluated by chemical method,hydrogen peroxide induced macrophage RAW
5、264.7 damage model,and the activity of scavenging DPPH free radicals,ABTS free radicals,O2-free radicals and cell antioxidant enzymes as indicators.The results showed that the components of FSA,FSB,FSH and FSI in Forsythia suspensa leaves had better scavenging ability on DPPH free radical,ABTS free
6、radical and O2-free radical.FSA,FSB,FSH and FSI could increase the activity of SOD and CAT in macrophages RAW264.7 induced by hydrogen peroxide,increase the content of reducing GSH,reduce the content of MDA,and improve the oxidative damage of cells induced by hydrogen peroxide.Through thermographic
7、analysis and principal component analysis,it was found that FSA,FSB,FSH and FSI were positively correlated with antioxidant capacity.The study indicates that the four phenylethanolamine glycosides of FSA,FSB,FSH and FSI in Forsythia suspensa leaves have good antioxidant activity,which are the main p
8、harmacological substances for its antioxidant activity.Key words:Forsythia suspensa leaves;phenylethanolamine glycosides;antioxidation;principal component analysis在当前高度集约化的现代养殖条件下，高密度饲养、通风不良、缺乏运动、高能饲粮日粮等不良因素导致在养殖过程中普遍存在氧化应激，使畜禽机体免疫力及生产性能受到严重影响1，在畜牧生产中使用抗氧化剂可以缓解氧化应激。但许多合成抗氧化剂具有潜在毒性和致癌作用，其安全性受到质疑2-3。因
9、此，开发天然安全无毒的中草药抗氧化剂成为研究的热点。连翘为木犀科连翘属植物，具有清热解毒、消肿散结的功效4。现代研究表明，连翘叶中的主要成分包括木脂素类5-6、苯乙醇苷类7-8、黄酮9、三萜酸10等，具有抗菌11、抗氧化12、保肝13和调节免疫14等功效。在我国河北、陕西等地有将连翘叶制成茶作为保健饮料饮用的习惯。2018年，国家卫健委批准连翘叶作为新食品原第一作者：王学方，硕士，助理研究员，研究方向为天然产物提取与功能活性。通信作者：李晓，硕士，副研究员。基金项目：河南省科技攻关项目（项目编号：222102310543、212102110095）；中央引导地方科技发展专项基金（项目编号：21
10、1213004）收稿日期：2022-07-20试验研究NO.02 202395饲料研究 FEED RESEARCH料，极大地促进了连翘叶的开发。目前，关于连翘叶的研究多集中于连翘果和叶等所含化学成分及结构定性定量的测定，而对连翘叶中实际发挥功效的药效物质基础研究较少。本试验以化学法、巨噬细胞RAW264.7模型为评价方法，对连翘叶中7种成分连翘苷（PHI）、连翘脂素（PHG）、松脂素-D-葡萄糖苷（PIN）、连翘酯苷A（FSA）、连翘酯苷B（FSB）、连翘酯苷H（FSH）和连翘酯苷I（FSI）的抗氧化活性进行研究，筛选出其抗氧化的主要药效物质，探讨了其抗氧化的作用效果，以期为连翘叶在畜禽生产中
11、的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料连 翘 叶 采 自 河 南 栾 川，自 然 晒 干，粉 碎，过20目筛。RPMI1640培养液、青链双抗和胎牛血清购自gibco公司，CCK-8试剂购自大连美仑生物技术有限公司，抗坏血酸、H2O2溶液购自美国Sigma公司，DPPH溶液购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，ABTS 试剂盒、O2-试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。NBS-U410型超低温冰箱、NBS-170S型二氧化碳培养箱购自德国Eppendorf公司，1300 SE
12、RIES A2型生物安全柜购自美国Thermo Scientific公司，CKX41-A32PC型倒置显微镜购自日本Olympus Corporation公司，Imark酶标仪购自美国Bio-Rad Laboratories公司。1.2测定指标及方法1.2.1样品制备前期研究中15采用D101大孔树脂法、硅胶柱色谱法和HPLC半制备等多种方法对连翘叶进行提取分离纯化，并通过MS、NMR等方法鉴定，得到了12个化合物分别为芦丁、PHI、PHG、PIN、表松脂素-D-葡萄糖苷、表松脂素-4-O-D-葡萄糖苷、forsythensid F、（+）-1-羟基松脂素-4-O-D-葡萄糖苷、FSI、FSH
13、、FSA、FSB。本研究选取其中的 7 种成分 PHI、PHG、PIN、FSI、FSH、FSA、FSB进行抗氧化活性研究。1.2.2体外抗氧化活性1.2.2.1DPPH自由基清除能力采用DPPH自由基清除试验检测连翘叶中7种成分的抗氧化活性。每种成分分别配制为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 g/L 的样品溶液（乙酸乙酯溶解）。取200 L不同质量浓度样品溶液于EP管中加入1 mL乙酸乙酯和 4 mL DPPH 溶液（1104 mol/L 乙酸乙酯溶解）振荡混匀，室温避光静置反应 30 min；空白管中加入1.2 mL 乙酸乙酯和 4 mL DPPH 溶液，对照管中加入2
14、00 L不同质量浓度的样品溶液和5 mL乙酸乙酯溶液，在517 nm波长处测定吸光度，计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率(K)=1-(A1-A2)/A0100%(1)式中：A1为200 L样品溶液1 mL乙酸乙酯+4 mL DPPH溶液（乙酸乙酯溶解）的吸光度；A2为200 L样品溶液5 mL乙酸乙酯溶液的吸光度；A0为1.2 mL乙酸乙酯4 mL DPPH溶液（乙酸乙酯溶解）的吸光度。1.2.2.2ABTS自由基清除能力采用ABTS自由基清除能力试剂盒检测连翘叶中7种成分的抗氧化活性。每种成分分别配制为0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0
15、、1.500 0、2.000 0 g/L 的样品溶液。取10 L不同质量浓度样品溶液于96孔板中，加入190 L ABTS工作液；空白管中加入10 L水和190 L ABTS工作液，对照管中加入10 L不同质量浓度样品溶液和190 L水，充分混匀，室温避光静置6 min，测定405 nm波长处的吸光度，计算ABTS自由基清除率。ABTS自由基清除率(D)=A0-(A2-A1)/A0100%(2)式中：A1为10 L样品溶液190 L ABTS工作液的吸光度；A2为10 L样品溶液190 L水的吸光度；A0为10 L水190 L ABTS工作液的吸光度。1.2.2.3O2-自由基清除能力采用O2
16、-自由基清除能力检测试剂盒检测连翘叶中7 种成分的抗氧化活性。每种成分分别配制成 0.125、0.250、0.500、0.800、1.000、1.500、2.000 g/L的样品溶液。取不同质量浓度样品溶液25 L于96孔板中，加入200 L超氧阴离子工作液，充分混匀，37 显色20 min；以空白管调零，对照管中加入25 L水和200 L O2-工作液，在530 nm处测定吸光度，计算O2-自由基清除率。O2-自由基清除率(I)=(A2-A1)/A2100%(3)式中：A1为25 L样品溶液200 L超氧阴离子工作液的吸光度；A2为25 L水样品溶液200 L超氧阴离子工作液的吸光度。1.2.3受试样品对 H2O2诱导巨噬细胞氧化损伤的保护作用1.2.3.1细胞培养RAW264.7巨噬细胞用RPMI1640培养基（含10%胎牛血清、5%双抗）在恒温培养箱5%CO2、37 条件下培养。1.2.3.2受试样品对巨噬细胞RAW264.7活性的影响将RAW264.7细胞按5103个/孔接种于96孔板上，培养24 h，加入100 L含不同水平样品的培养液，作用24 h，以换液的形式加入 100