1、 148 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 龙须菜(Gracilariopsis)/江蓠(Gracilaria)的生长和种质特性分析 宣雯燕,张莹莹,陈琼琳,罗素雅,孙 雪,徐年军(宁波大学海洋学院 浙江省海洋生物工程重点实验室,浙江 宁波 315211)摘要:龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是具有重要经济价值和生态效益的大型红藻,主要用作琼胶提取原料和鲍的饵料。本研究利用生理生化、液相色谱-质谱联用和氨基酸分析等方法,比较了龙须菜(Gp.lemaneiformis)(wt、981、Gl-1、Gl-s、Gl-g)、异枝龙须菜(Gp.heter
2、ocla,Gh)和细基江蓠繁枝变种(Gracilaria tenuistipitata var.liu,Gt)的生长及藻胆蛋白、琼胶、红藻糖苷和氨基酸等的差异,以期为龙须菜/江蓠栽培中的种质区分及选择提供参考。结果表明 Gt 在 23 和 30 条件下生长均最快,其相对生长速率分别为野生型龙须菜(wt)的 2.19 倍和 2.49 倍。龙须菜 Gl-s 中藻胆蛋白浓度最高,为 wt的 1.91 倍。除了 Gt 之外,其余 6 种藻中琼胶产率较高(16.22%18.91%)。Gt 中红藻糖苷和海藻糖积累最多,分别为 wt 的 3.50 倍和 1.81 倍。Gl-g、Gl-s、Gt 和 Gh 多糖
3、丰富,在 36.89%40.23%;龙须菜 981、Gl-1、wt 和 Gl-s 总氨基酸浓度较高,在 152.35161.32 mgg1干质量之间,并且 981、Gl-1、Gl-s 氨基酸评分较优。综合以上结果,龙须菜 981、Gl-1 和 Gl-s 的藻胆蛋白、琼胶和氨基酸等均显著优于其他藻,并且生长较快,可用于琼胶、藻胆蛋白及多糖的提取或鲍的饵料;而细基江蓠繁枝变种生长快、红藻糖苷和海藻糖丰富,可大规模栽培用作鲍的饵料。该研究为丰富及开发利用中国大型海藻种质资源提供了重要的资料。关键词:龙须菜(Gracilariopsis);江蓠(Gracilaria);生长;种质;琼胶 中图分类号:S
4、917.3 文献标识码:A 文章编号:1000-3096(2022)12-0148-11 DOI:10.11759/hykx20210119001 龙须菜属(Gracilariopsis)是大型红藻江蓠目(Gra-cilariales)中的一个属,由 Bird 等1根据 18S rDNA等基因序列将其从江蓠属(Gracilaria)中分出来。龙须菜属和江蓠属中的很多种都具有重要的经济价值,是提取琼胶的主要原料,同时也是鲍等水产生物饵料。据2020 年中国渔业统计年鉴数据,中国江蓠属海藻,主要是龙须菜(Gp.lemaneiformis)在 2019 年产量为 3.481105 t 干品,已成为产
5、量第二的大型栽培海藻2。此外,龙须菜藻胆蛋白可以作为天然色素用于食品、化妆品及荧光探针3;龙须菜多糖还具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等多种生物活性4-5。野生型龙须菜分布于中国北方海域的沙沼、砾石或覆沙的岩礁,春、秋两季生长,生长期短,自然资源量少。后来,耐高温、高产龙须菜新品系相继选育成功,如龙须菜 981、鲁龙 1 号等。这些优良的龙须菜选育品系在中国山东、福建等海域栽培,带来了巨大的经济和生态效益,形成了大规模的龙须菜产业。龙须菜作为一种重要的栽培藻类资源,其相关的研究多集中在琼胶6-7、逆境胁迫8-9、生态效益10等方面,而关于龙须菜种质特性的报道相对较少。海区栽培龙须菜主要依靠营养繁殖,
6、栽培人员多根据藻体颜色、粗细和分枝多少等来区分所用的藻种。龙须菜长期生活在不同海区环境中,不仅藻体形态上有所差别,而且其理化特性等也发生了较大的变化。因此,本研究从山东、福建、广东采集了野生型和栽培的龙须菜、异枝龙须菜(Gp.heterocla)和细基江蓠繁枝变种(Gracilaria tenuisti-pitata var.liui),对这些龙须菜/江蓠进行生长、生化组成和种质特性的比较,为龙须菜栽培生产中 收稿日期:2021-01-19;修回日期:2021-03-03 基金项目:国家重点研发计划(2018YFD0901502),宁波市重大科技专项项目(2019B10009),宁波市重大科技
7、攻关项目(2021Z114)Foundation:National Key R&D Program of China,No.2018YFD0901502;Key Program of Science and Technology Innovation in Ningbo,No.2019B10009;Major Project of Science and Technology in Ningbo,No.2021Z114 作者简介:宣雯燕(1994),女,汉族,浙江湖州人,硕士,研究方向为藻类生理生化,E-mail:;孙雪(1974),通信作者,女,博士,研究员,研究方向为藻类生理与分子生物学,
8、E-mail: Marine Sciences/Vol.46,No.12/2022 149 的种质选用及种质资源开发利用提供资料。1 材料与方法材料与方法 1.1 实验材料实验材料 本实验共选用 7 种海藻材料:野生型龙须菜(wt)、龙须菜 981、龙须菜 Gl-1、龙须菜 Gl-s、绿色龙须菜(Gl-g)、异枝龙须菜(Gh)和细基江蓠繁枝变种(Gt),其中 Gh 和 Gt 由谢恩义老师帮忙采集。藻体采集信息及形态等特征见表 1。采集回来的海藻经过海水充分清洗、去除表面泥沙和附着物后,在 23、盐度 25、30 molm2s1光照强度和 12L12D 光周期的光照培养箱中进行培养。表 1 龙须
9、菜/江蓠来源和颜色、形态信息 Tab.1 Information on the origin,color,and morphology of the Gracilariopsis/Gracilaria seaweeds 藻名称 简写 采集时间 采集地点 颜色 形态 野生型龙须菜 wt 2019 年 6 月 山东青岛 红褐色 藻体细短、分枝多 龙须菜 981 981 2019 年 6 月 福建霞浦 红褐色 藻体细长、分枝多 龙须菜 Gl-1 Gl-1 2019 年 6 月 福建连江 红褐色 藻体细长、分枝多且短 龙须菜 Gl-s Gl-s 2019 年 6 月 福建连江 红褐色 藻体主枝粗、有韧
10、性、分枝多 绿色龙须菜 Gl-g 2019 年 8 月 福建霞浦 鲜绿色 藻体整体较粗、分枝较少 异枝龙须菜 Gh 2019 年 11 月 广东湛江 黄绿色 藻体扁平、粗壮、分枝多 细基江蓠繁枝变种 Gt 2019 年 11 月 广东湛江 黄褐色 藻体细小、较脆、分枝密集 1.2 相对生长速率测定相对生长速率测定 分别选取68 cm长的幼嫩藻体810根,用滤纸充分吸干表面水分,准确称取藻体鲜质量(FW)。在23 和 30,分别培养 5 d 后再次称取藻体鲜质量,每组设置 3 个重复。根据以下公式来计算各藻的相对生长速率(RGR,%d1)11:RGR=(lnWt-lnW0)/t100%,其中 W
11、0为实验开始时藻体鲜质量,Wt为实验结束时藻体鲜质量,t 为培养天数。1.3 藻胆蛋白浓度测定藻胆蛋白浓度测定 参考朱招波等12进行藻体的总藻胆蛋白的提取及各藻胆蛋白藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)和别藻蓝蛋白(APC)的测定。按照公式 CPE=0.123A565-0.068A615+0.015A650,CPC=0.162A615-0.001A565-0.098A650,CAPC=0.171A650-0.006A565-0.004A615来计算 3 种藻胆蛋白的浓度,其中 C 代表浓度,A 代表吸光度。1.4 琼胶产率测定琼胶产率测定 参照汤小彬等13的方法稍有改动。准确称取 0.5 g藻体
12、(干质量,DW),用 NaOH 碱处理法提取琼胶。按照公式:Y=A/B100%来计算藻体的琼胶产率,其中 Y为琼胶产率(%),A 为琼胶干质量,B 为藻体干质量。1.5 红藻糖苷红藻糖苷/异红藻糖苷、海藻糖浓度测定异红藻糖苷、海藻糖浓度测定 将冷冻干燥的龙须菜在液氮中充分研磨成粉末,再准确称取 10 mg 干藻粉,参照 Lv 等14方法进行样品的研磨、提取、干燥、超声波处理等,最后取上清液过 0.22 m 有机相滤膜后上机分析。使用 Thermo Fisher Scientific 的液相色谱-质谱联用仪(LC-MS,其中高效液相色谱仪为 U3000 型、质谱仪为 Q-Exactive型)进行
13、 3 种糖的测定。以坛紫菜中红藻糖苷和异红藻糖苷及 D-(+)-海藻糖(Sigma-Aldrich)为标准品。使用 Xcalibur(Thermo Fisher Scientific)软件进行 LC-MS数据获取和分析。1.6 多糖、总蛋白、灰分浓度测定多糖、总蛋白、灰分浓度测定 藻体的多糖测定采用蒽酮-硫酸比色法,使用南京建成生物工程研究所的相应试剂盒进行;总蛋白质测定采用凯氏定氮法;灰分测定参考 GB 5009.4 1985 食品中灰分的测定方法15。1.7 氨基酸浓度测定和评分氨基酸浓度测定和评分 准确称取 0.1 g 冻干研磨后藻粉置于厌氧水解管中,加入盐酸水解过滤后真空干燥,加入 1
14、 mL样品稀释液(pH 2.2)溶解,用 0.22 m 水系滤膜过滤后在全自动氨基酸分析仪(Sykam,S-433D)上进行氨基酸检测。检测波长 570 nm 和 440 nm;5874 梯度温控;进样量 0.05 mL;流动相:柠檬酸钠 A浓度为 0.12 molL1(pH 3.45),B 浓度为 0.2 molL1(pH 10.85);流速:洗脱泵 0.45 mLmin1,衍生泵 150 海洋科学/2022 年/第 46 卷/第 12 期 0.25 mLmin1;压力:34 MPa。用藻体中某种氨基酸浓度占联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)评分模式中该氨基酸浓度的百分比来表征该
15、氨基酸的评分。1.8 数据分析数据分析 使用 Excel 2019 进行数据处理,利用 OriginPro 2018 进行作图。实验数据均以平均值标准差(mean SD)表示,并采用 SPSS 22.0 进行 one-way ANOVA(Duncan)或 T-test 分析,以 P0.05 为差异显著水平。2 结果与分析结果与分析 2.1 龙须菜龙须菜/江蓠的形态比较江蓠的形态比较 在 7 种龙须菜/江蓠材料中,Gl-g、Gh 和 Gt 在颜色上很容易与其他 4 种龙须菜区分(图 1 和表 1);另外 4 种龙须菜藻体均呈现红褐色。在形态上,龙须菜wt、981 和 Gl-1 藻体细长多分枝,龙
16、须菜 Gl-s、Gl-g藻体较为短小、粗壮,其中 Gl-s 藻体具有韧性,不易折断;Gh 藻体较为扁平粗壮、分枝多,而 Gt 藻体分枝密且短、脆弱易断。图 1 龙须菜/江蓠形态图 Fig.1 Morphology of the Gracilariopsis/Gracilaria seaweeds 注:wt 为野生型龙须菜,981 为龙须菜 981,Gl-1 为龙须菜 Gl-1,Gl-s 为龙须菜 Gl-s,Gl-g 为绿色龙须菜,Gh 为异枝龙须菜,Gt 为细基江蓠繁枝变种 2.2 龙须菜龙须菜/江蓠的生长比较江蓠的生长比较 在常温和高温条件下,龙须菜/江蓠生长速率不同(图 2)。在常温 23 时,Gt 生长最快,其 RGR为4.36%d1,为 wt 的 2.19 倍;其次是 wt、981 和 Gl-1,其 RGR在 1.65%d11.99%d1之间;Gl-s、Gl-g、Gh生长缓慢(0.51%d10.70%d1)。在 30 时 Gt 生长也最快(RGR为 3.88%d1),为 wt 的 2.49 倍;其次是981、Gl-1、Gl-s,其 RGR在 1.95%d12.83%d1之间;生