1、广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2023 Jan；40（1）绿原酸对不同水平环二鸟苷酸铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响*谭政，孔晋亮，罗劲，刘六媛，杨婷（广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，南宁530021）摘要目的：研究绿原酸对不同水平环二鸟苷酸（c-di-GMP）铜绿假单胞菌（P.a）早期和成熟生物被膜（BF）的抑制作用。方法：用液体培养基稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）。构建3种P.a菌株PAO1、P.a胞内c-di-GMP高表达菌株（PAO1wspF）和P.a胞内c-di-GMP低表达菌株（PAO1/Plac-yhjH）B
2、F体外模型，分别分为空白对照组和不同浓度的绿原酸（1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC）组。结晶紫染色半定量法测定3 d及7 d载体表面BF总量，连续稀释法计数绿原酸作用3 d及7 d后BF内活菌，观察绿原酸对运动能力的影响。结果：在绿原酸的作用下，无论3 d还是7 d载体表面所形成BF均少于空白对照组（P0.05），BF内活菌均较空白对照组少（P0.05），3种菌株的运动区域直径均小于空白对照组（P0.05）。结论：绿原酸对不同水平c-di-GMP P.a早期和成熟BF均具有抑制作用，对BF内活菌具有良好的杀灭效果，影响其运动能力。关键词绿原酸；c-di-GMP；生物被膜；铜绿假单
3、胞菌中图分类号：Q2-33文献标志码：A文章编号：1005-930X（2023）01-0066-05DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2023.01.011Effects of chlorogenic acid on biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa with differentlevels of cyclic diguanosineTan Zheng,Kong Jinliang,Luo Jin,Liu Liuyuan,Yang Ting.(Department of Respiratory and Critical Ca
4、re Medi-cine,The FirstAffiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)AbstractObjective:To study the inhibitory effects of chlorogenic acid on the early and mature biofilm(BF)ofPseudomonas aeruginosa(P.a)at different levels of cyclic diguanosine(c-di-GMP).Methods:The minimum i
5、n-hibitory concentration(MIC)was determined by liquid medium dilution method.BF models of three P.a strains-PAO1,P.a strain with high expression of intracellular c-di-GMP(PaO1wspF)and P.a strain with low expressionof intracellular c-di-GMP(PAO1/Plac-yhjH)were constructed in vitro and the models were
6、 divided into blank con-trol group and chlorogenic acid(1/2 MIC,1/4 MIC,1/8 MIC)group with different concentrations.The totalamount of BF on the carrier surface of 3 d and 7 d was determined by semi-quantitative crystal violet staining,and the viable bacteria in BF after 3 and 7 days of chlorogenic
7、acid treatment were counted by continuous dilu-tion method to observe the effects of chlorogenic acid on exercise ability.Results:Under the action of chlorogen-ic acid,the BF formed on the carrier surface of both 3d and 7d was less than that of the blank control group(P0.05),the number of viable bac
8、teria in BF was less than that of the blank control group(P0.05),and the diame-ter of the moving area of the three strains was smaller than that of the blank control group(P0.05).Conclu-sion:Chlorogenic acid can inhibit early and mature BF of P.a at different levels of c-di-GMP and has a good kill-i
9、ng effect on BF live bacteria,affecting their exercise ability.Keywordschlorogenic acid;c-di-GMP;biofilm;Pseudomonas aeruginosa*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.81760743）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-10-24铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.a）是一种革兰阴性杆菌，已成为感染的重要病因，特别是在宿主防御机制受损的患者中。其通常与院内感染有关，例如肺炎、尿路感染和菌血症1。P.a对多种抗生素具有多重耐药性，
10、其生物被膜（biofilm，BF）的形成是产生耐药性的主要原因2。细胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）构建 66了BF的功能和结构完整性，细菌在EPS的包裹下形成微群落，限制抗生素的扩散及其对细胞的获取，大大增加了对抗生素的耐药性3。环二鸟苷酸（c-di-GMP）作为细菌胞内的第二信使，是P.a从浮游生物向BF生长模式过渡的一个重要因素4。高水平的c-di-GMP与BF形成有关，而低水平的c-di-GMP与浮游生物单细胞细菌生活方式相关5。绿原酸（chlorogenic acid）是中草药金银花的主要活性成分。本研究旨在探讨绿原酸对不同水
11、平c-di-GMPP.a BF形成的作用，为研发抗P.a BF药物提供理论基础。1材料与方法1.1BF体外模型的载体构建将医用聚氯乙烯薄片裁成直径为10 mm的圆形薄片，用75%乙醇浸泡过夜，灭菌备用。1.2菌株P.a菌株PAO1由丹麦哥本哈根大学临床微生物科惠赠，P.a 胞内 c-di-GMP 高表达菌株（PAO1wspF）和 P.a 胞内 c-di-GMP 低表达菌株（PAO1/Plac-yhjH）均由新加坡南洋理工大学生命科学学院杨亮教授惠赠。1.3主要试剂与仪器绿原酸（国家食品药品检定研究所，批号：110753-202018）；LB琼脂（中国陆桥技术责任有限公司）；LB液体培养基（中国
12、陆桥技术责任有限公司）；结晶紫；二甲基亚砜（DMSO，索莱宝）；医用聚氯乙烯薄片（上海景年医疗器械有限公司）；酶标仪（美国Thermo公司）。1.4菌株准备PAO1、PAO1wspF 用 LB 琼脂复苏，用LB液体培养基培养过夜。PAO1/Plac-yhjH用含四环素的LB琼脂复苏，用含四环素的LB液体培养基培养过夜。1.5药物最低抑菌浓度（MIC）测定采用CLSI液体 培 养 基 常 量 稀 释 法6测 定 绿 原 酸 对 PAO1、PAO1wspF、PAO1/Plac-yhjH的MIC，实验独立重复3次。1.6BF体外模型制备7取含PAO1、PAO1wspF、PAO1/Plac-yhjH
13、3种菌株的LB液体培养基，离心，收集菌体，用LB液体培养基稀释，测定吸光度（OD）600=0.1后，取1 mL菌悬液分别置于24孔细胞培养板中，同时放入无菌BF载体1个。37 培养24 h后更换培养液，之后隔天更换培养液，3 d后可形成早期BF，7 d后可形成成熟BF。1.7绿原酸对 BF 形成的抑制实验将 3 种菌株（PAO1、PAO1wspF、PAO1/Plac-yhjH）分别分为空白对照组和不同浓度的绿原酸组，绿原酸组在BF建模时加入绿原酸，使其终浓度分别为1/8 MIC、1/4MIC、1/2 MIC。空白对照组不加入任何药物。37 培养24 h后用相同液体分别更换各组培养液，之后每48
14、 h换液。于第3、第7天取出载体，无菌生理盐水轻轻漂洗3次后，观察载体表面BF量并计数BF内活菌。1.8结晶紫染色半定量法观察载体表面BF量分别使用10 mL无菌生理盐水漂洗上述第3、第7天各组载体表面浮游菌，置于新的24孔细胞培养板中，室温干燥，加入1 mL 1%结晶紫染色20 min；再次用无菌生理盐水轻轻漂洗未结合的结晶紫，室温干燥后加入1 mL 33%冰醋酸脱色3 min。吸取200 L洗脱液至96孔板，酶标仪测定590 nm波长处各孔的OD值，实验重复3次。1.9连续稀释法计数BF内活菌使用10 mL无菌生理盐水充分漂洗上述第3、第7天各组载体表面浮游菌后，将载体放入含有1 mL无菌
15、生理盐水的灭菌试管中，2 300 r/min漩涡震荡15 min，使载体上BF内细菌脱落至生理盐水中形成细菌悬液，然后用连续稀释法计数BF内活菌，实验独立重复3次。1.10泳动实验和群集运动实验8在无菌平板中加入0.3%琼脂和LB液体培养基，分组处理后，取含PAO1、PAO1wspF、PAO1/Plac-yhjH 3 种菌株的 LB液体培养基，离心，收集菌体，用LB液体培养基稀释测OD600=0.5后，将10 L各菌株菌液接种于上述平板表面中央位置，37 培养24 h后，观察以接种点为中心的云雾状同心圆区域以及以细菌接种点为中心形成的区域，实验重复3次。1.11统计学方法采用SPSS 16.0
16、 统计软件进行数据处理，计量资料以均数标准差（x s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1MIC 测定结果绿原酸浓度为 4 096 g/mL时，肉眼观察到3种菌株的液体培养基均澄清，而低于此浓度的培养基混浊。由此判断，绿原酸对PAO1、PAO1wspF、PAO1/Plac-yhjH 的 MIC 均 为4 096 g/mL。2.23 d、7 d后绿原酸对BF形成的抑制作用3 d后，在 PAO1、PAO1/Plac-yhjH 菌株中，1/2 MIC、1/4谭政,等.绿原酸对不同水平环二鸟苷酸铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响 67广西医科大学学报2023 Jan；40（1）MIC绿原酸组载体表面BF量均少于空白对照组（P0.05），1/8 MIC绿原酸组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P0.05）；在 PAO1wspF 中，1/2MIC、1/4 MIC、1/8 MIC 绿原酸组载体表面BF量均少于空白对照组（P0.05）。7 d 后，在PAO1wspF、PAO1/Plac-yhjH中，1/2 MIC、1/4 MI