1、基金项目：国家自然科学基金项目（）通信作者：论著慢性间歇性限制摄食对大鼠恐惧记忆维持的影响李颜行，孟适秋，王汉卿，唐紫莹，薛言学，吴 萍，（.北京大学基础医学院药理系，北京；.北京大学中国药物依赖性研究所，药物依赖性研究北京市重点实验室，北京）摘要：目的 研究慢性间歇性限制摄食对大鼠条件性恐惧记忆维持和焦虑样行为的影响。方法雄性 大鼠接受听觉条件性恐惧记忆训练，随后进行为期 周的间歇性限制摄食；之后进行恐惧记忆、高架迷宫和自发活动测试。结果 与正常摄食组大鼠相比，限制摄食 周大鼠的听觉恐惧记忆水平显著降低，进入高架迷宫开放臂的次数和时间显著增加，提示限制摄食降低恐惧记忆的维持，且降低动物的焦虑
2、水平。结论限制摄食能够降低恐惧记忆的维持，为治疗恐惧记忆相关疾病提供了新的思路。关键词：恐惧记忆；限制摄食；维持；焦虑样行为中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（.，；，）：，：；恐惧记忆是进化赋予生物个体的保护机制，它的存在使个体能够更好地记住那些可能给生命带来威胁的事件，并避免它再次发生。因此，正常的恐惧记忆是生命所必须的，有利于机体适应多变的外界环境。而过度的恐惧记忆则会给机体带来诸多不利影响，长期持续存在的严重恐惧记忆甚至可能引发相关的神经精神疾病，如创伤后应激障碍（，）。这些疾病发生机制复杂，往往伴有认知功能受损、焦虑、抑郁等症状，严重影响患者的健康及生活质量。消除持久强烈的恐
3、惧记忆是治疗此类疾病的关键，然而目前尚缺乏疗效持久且易于操作的治疗手段。大量研究成果表明，限制摄食作为一种饮食干预手段，不仅能起到减轻体重、延缓衰老、延长寿命的作用，还能显著降低许多疾病的发病风险，如神经退行性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、型糖尿病和癌症等。此外，合理的限制摄食还能有效改善认知，调节情绪，改善大脑神经可塑性。针对阿尔兹海默病（，）、帕金森病、亨廷顿病和中风等动物模型的研究表明，限制摄食能够保护神经元使其避免发生变性、退化。限制摄食能够通过刺激干细胞形成新生神经元，增加突触可塑性，从而增加大脑抵抗衰老的能力，促进脑损伤后的功能恢复。早期研究表明限制摄食能中国药物依赖性杂志（）
4、，（）：够改善老年大鼠和小鼠的学习能力缺陷。进一步机制研究发现，限制摄食能够逆转老年动物的长时程增强（，）缺失，影响突触数量、结构和功能，从而保护中枢神经系统。同时，有研究发现，对成年大鼠进行限制摄食干预后，其视皮层神经可塑性可从稳定水平恢复至幼年期的活跃水平，而且这一变化可能是通过增强组蛋白 乙酰化水平而实现的，这提示限制摄食可能通过表观遗传学调控机制增强成年期神经的可塑性水平。因此，我们推测限制摄食可能通过调节神经可塑性而影响条件性恐惧记忆的维持。材料与方法.实验动物所用实验动物均为雄性（）大鼠，约 月龄，体重约 ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为（京）。实验动物均饲养在恒
5、定节律的动物房（光照时间：），并保持房间恒温（）恒湿（）。动物在送到动物房后、正式实验前至少经历了 天的环境适应期，期间每天定时进行抚摸。适应期间每笼饲养 只，限制摄食期间进行单笼饲养。实验动物所接受的所有操作均符合实验动物伦理学规定，遵循国家和北京大学医学部动物使用和保护委员会颁布的条例。.实验方法.慢性间歇性限制摄食 参考既往研究建立 天间歇性限制摄食模型。对于限制摄食组的大鼠，采取隔日间歇禁食的方式饲养，放置和收取剩余饲料的时间为每天中午：。具体流程如下：实验第 天，给予限制摄食组大鼠足量的饲料，大鼠可以自由饮水进食；实验第 天取出未吃完的所有饲料，不限制饮水，两天一个循环，后续操作以此
6、类推，整个造模过程持续 天。对照组大鼠全程自由饮水进食。限制摄食过程中，每天记录大鼠的摄食量，每周一次记录大鼠的体重。.听觉条件恐惧记忆听觉恐惧记忆的实验方法参考既往研究。在恐惧记忆训练前 天，每天将大鼠放入训练箱内 分钟，并定期抚摸大鼠，以降低应激反应。训练箱外套不透光的隔音箱，以屏蔽外界环境对训练和测试的影响。恐惧记忆训练时，将大鼠置于恐惧训练箱内，实验结后放回原笼饲养。采用 软件记录和处理大鼠的僵直行为。听觉恐惧记忆训练：训练方案为 个周期，共 秒，分别在、和 秒处施予 秒的 级白噪声，作为条件性刺激（，），并且分别在、和 秒处施予维持 秒的.电击作为非条件性刺激（，），形成 的关联。训
7、练结束后，计算每次电击后 分钟内大鼠呈现僵直行为（）的时间百分比平均值，作为恐惧记忆的指标。的定义为除呼吸外无其它任何动作。如果最后一次电击后 分钟内的 时间百分比大于或等于 ，则认为训练成功，否则重新训练，两次训练不成功的大鼠将被剔除。听觉恐惧记忆测试：恐惧记忆测试的实验方案为：个循环，共 秒，分别在、和 秒处施予 秒的 级白噪声（），不给予电击（无）。统计 次噪声期间的 比例。.高架十字迷宫测试 高架十字迷宫的测试方法参考既往研究。高架十字迷宫的测试装置由两个开放臂（）、两个闭合臂（，高）和中央区域（）组成，装置距地面 。将高架十字的开臂及闭臂组装后开始实验，将大鼠从中央格面向闭合臂放入迷
8、宫，记录 分钟内的活动情况。观察其进入开放臂的次数（必须有两只前爪进入臂内）、开放臂停留时间、闭合臂进入次数和闭合臂停留时间。实验完成后将大鼠取出，将两臂清理干净，并喷洒酒精除去气味。在高架十字实验中，我们选取进入开放臂的次数百分比和开放臂的停留时间百分比作为焦虑样行为的指标。.自发活动 自发活动测试的实验方法参考既往研究。将自发活动记录仪清理干净，确保内部没有水等反光面，将实验大鼠放入其中，关闭仪器门，确保不透光，不透声。实验大鼠自由探索 分钟后将其取出，记录运动轨迹和距离，并将箱体清理干净。.统计分析方法本研究结果均以平均值 标准误（）表示，采用 .进行统计分析，在 数 据 分 析 前 先
9、 用 对正态分布进行检验，再用 进行方差齐性检验。对于焦虑样行为和自发活动测试结果，如果数据服从正态分布采用非配对样本 检验，不服从正态分布采用 秩和检验。对于恐惧记忆测试、摄食量和体重变化结果，采用重复测量方差分析进行统计分析，并采用 进行后续比较。所有结果均以 .作为显著性分析标准。中国药物依赖性杂志（），（）：结果.限制摄食对大鼠条件性恐惧记忆维持的影响如图 所示，大鼠在第 天接受听觉条件性恐惧记忆训练后，第 天进行恐惧记忆测试，随后接受为期 周的慢性间歇性限制摄食干预（隔日禁食），然后测试恐惧记忆的维持。以是否进行限制摄食为组间因素，以不同测试时间作为组内因素，采用重复测量方差分析对大
10、鼠的行为学结果进行分析发现（图），限制摄食与测试时间存在显著交互作用（，）.，.）；限制摄食（，）.，.）与测试时间（，）.，.）均对 测试值存在显著主效应。后续通过 进行多重比较，发现限制摄食组大鼠在恐惧记忆维持测试（）中的 值显著低于正常饲养的对照组大鼠（.），且显著低于恐惧记忆训练测试（）中的 值（.），同时，正常饲养组大鼠恐惧记忆维持测试的 值与恐惧训练的 值相比无显著性差异，提示恐惧习得后进行 天的慢性限制摄食能够显著抑制恐惧记忆的维持。图 慢性间歇性限制摄食对大鼠条件性恐惧记忆维持的影响注：（）实验流程图。（）限制摄食前后的恐惧记忆变化：与对照组正常饲养的大鼠相比，为期 周的慢性间
11、歇性限制摄食显著抑制大鼠条件性恐惧记忆的维持。结果以平均值 标准误（）表示，每组 ，采用重复测量方差分析进行统计。.，与对照组相比；.，与恐惧记忆训练测试（）相比；，对照组；，限制摄食组。.慢性间歇性限制摄食期间大鼠的体重变化和摄食量在限制摄食干预过程中，每天记录两组大鼠的饲料摄入量，并每周一次记录两组大鼠的体重。首先是大鼠体重变化的分析（图 ），以是否进行限制摄食为组间因素，以不同测试时间作为组内因素，采用重复测量方差分析对大鼠的体重变化进行分析发现（图），限制摄食与测试时间存在显著交互作用（，）.，.）；限制摄食（，）.，.）与测试时间（，）.，.）均对体重测试值存在显著主效应。后续通过
12、进行多重比较，发现限制摄食组大鼠第 天、第 天、第 天和第 天的体重值均显著低于正常饲养的对照组大鼠（.），提示 天的慢性间歇性限制摄食能够显著抑制大鼠的体重增加。接下来对大鼠体重及进食量进行分析。图 反映了限制摄食期间两组大鼠饲料总摄入量的情况，可以看到慢性间歇禁食期间，限制摄食组大鼠进食量显著减少（.，.），图 是 天间歇性限制摄食期间的大鼠摄食量变化图。因限制摄食组大鼠仅在实验偶数日进食，故对每两日大鼠进食量进行了一次平均，并以是否进行限制摄食为组间因素，以不同测试时间作为组内因素，采用重复测量方差分析对每两日平均进食量进行进一步分析，发现限制摄食与测试时间存在显著的交互作用（，）.，.
13、）；限制摄食（，）.，.）与测试时间（，）.，.）对体重测试值均存在显著主效应，后续通过 进行多重比较，发现限制摄食组大鼠每两日平均摄食量均显著低于正常饲养组（.），提示慢性间歇性限制摄食显著抑制了大鼠的进食量。.限制摄食对大鼠自发活动和焦虑样行为的影响如图 所示，将大鼠随机分为正常饲养组和限制摄食组大鼠，完成为期 周的慢性间歇性限制摄食后，进行自发活动和高架十字迷宫测试。采用 内的自发活动距离、进入高架十字迷宫开放臂的次数百分比和在高架十字迷宫开放臂的停留时间百分比作为行为学指标，采用非配对 检验进行统计分析。自发活动测试结果显示（图），自发活动测试表明，天隔日间歇禁食不会导致大鼠出现运动异
14、常（.，.，图 ）。而在反映焦虑样行为的高架十字迷宫测试中，与正常饲养组大鼠相比，限制摄食组大鼠进入开放臂的次数（.，.，图 ）和时间（.，.，图 ）均显著增加，提示恐惧习得后进行 天的慢性限制摄食显著增加了大鼠的抗焦虑能力。中国药物依赖性杂志（），（）：图 慢性间歇性限制摄食期间大鼠的体重变化和摄食量注：（）天间歇性限制摄食期间大鼠体重变化图：与对照组正常饲养的大鼠相比，为期 周的慢性间歇性限制摄食延缓了大鼠的体重增加。（）天间歇性限制摄食期间大鼠的总摄食量情况。（）天间歇性限制摄食期间的大鼠摄食量变化图：与对照组正常饲养的大鼠相比，限制摄食组大鼠的总体摄食量没有显著差异。结果以平均值 标准
15、误呈现，采用重复测量方差分析进行统计，.，.，.，.与对照组相比；，对照组；，限制摄食组。图 慢性间歇性限制摄食对大鼠自发活动和焦虑样行为的影响注：（）实验流程图。（）限制摄食对自发活动的影响，结果显示限制摄食增加了大鼠的自发活动（.，.）。（）限制摄食对焦虑样行为的影响。大鼠在高架十字迷宫测试中进入开放臂的次数百分比（），结果显示限制摄食组大鼠进入开放臂次数明显增加（.，.）。大鼠在高架十字迷宫测试中进入开放臂的时间百分比（），结果显示限制摄食大鼠的开放臂停留时间显著延长（.，.）。结果以平均值 标准误呈现，采用非配对样本 检验进行统计。.，与对照组相比；，对照组；，限制摄食组。中国药物依赖
16、性杂志（），（）：讨论本研究采用为期 周的隔日禁食方案建立慢性间歇性限制摄食模型，首先探究了其对大鼠听觉条件性恐惧记忆维持的影响，发现限制摄食能够显著抑制恐惧记忆的维持。既往研究发现，啮齿类动物经历为期 小时的急性禁食后，小鼠消退记忆的学习速率更快，且在随后的恐惧记忆测试中恐惧反应不易恢复，此外，小时的短期禁食还可破坏恐惧记忆的获得。我们课题组既往的临床研究发现，急性禁食不影响恐惧记忆的获得过程，但是能够促进恐惧记忆的消退与消退记忆的维持，均与本研究结果一致，提示限制摄食可能通过影响恐惧记忆消退而抑制恐惧记忆的维持，其机制与神经元突触可塑性的增加、神经元线粒体代谢效率提高密切相关。未来希望能有更多研究，以进一步探明限制摄食抑制恐惧记忆的神经生物学机制。随后我们分析了限制摄食干预期间大鼠的体重和摄食量变化，发现限制摄食显著延缓了大鼠的体重增加，但是总体摄食量没有显著差异，这一结果与既往研究结果一致，说明大鼠能够适应慢性限制摄食这一干预方案，采用限制摄食干预恐惧记忆相关疾病具有可行性。既往研究表明，限制摄食除了直接影响实验动物体重外，还可通过改变机体代谢通路，使得血糖水平降低，体内酮体、游