1、咪达唑仑调控 mi-214/MAPK/EK-CEB 通路对缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖及凋亡的影响舒蕤赵立芳彭井印张如意(滨州医学院附属医院麻醉科，山东滨州256603)摘要 目的探讨咪达唑仑对缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖、凋亡的影响及其对 mi-214/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(EK)-环磷腺苷效应元件结合蛋白(CEB)通路的调控作用。方法采用缺氧复氧诱导大鼠海马神经元细胞建立细胞损伤模型(缺氧复氧组)，加入不同剂量的咪达唑仑处理细胞(3、6、12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组);实验分组:NC 组(未经处理的大鼠海马神经元细胞)、12 mol
2、/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-mi-con 组(anti-mi-con 转染入大鼠海马神经元细胞后加入12 mol/ml 咪达唑仑处理24 h 后进行缺氧复氧处理)、12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-mi-214 组(anti-mi-214 转染入大鼠海马神经元细胞后加入 12 mol/ml 咪达唑仑处理 24 h 后进行缺氧复氧处理)、PD98059+12 mol/ml咪达唑仑+缺氧复氧+anti-mi-214 组(anti-mi-214 转染入大鼠海马神经元细胞后加入 12 mol/ml 咪达唑仑与50 mol/L抑制剂 PD98059 处理24 h 后进行缺氧复氧
3、处理);采用噻唑蓝(MTT)实验检测细胞活力;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;采用实时荧光定量(qT)-聚合酶链反应(PC)检测 mi-214 的表达量;采用 Western 印迹检测 MAPK、p-EK、p-CEB、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2 和 Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)蛋白表达量。结果与 NC 组比较，缺氧复氧组细胞活力明显降低，Bcl-2 蛋白水平与 mi-214 的表达水平明显降低，凋亡率与 Bax、MAPK、p-EK、p-CEB 蛋白水平升高(P0.05);与缺氧复氧组比较，咪达唑仑不同剂量组细胞活力明显升高，Bcl-2 蛋白水平与 mi-214 的表达水平明显升高，凋亡率
4、与 Bax、MAPK、p-EK、p-CEB 蛋白水平明显降低(P0.05);与12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-mi-con 组比较，12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-mi-214组细胞活力与 Bcl-2 蛋白水平明显降低，凋亡率与 Bax、MAPK、p-EK、p-CEB 蛋白水平明显升高(P0.05);与 12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-mi-214 组比较，PD98059+12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-mi-214 组细胞活力与Bcl-2 蛋白水平明显升高，凋亡率与 MAPK、p-EK、p-CEB、Bax 蛋白水平明显降
5、低(P0.05)。结论咪达唑仑可通过上调 mi-214 的表达而抑制MAPK/EK-CEB 通路的活化从而促进缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖及抑制细胞凋亡。关键词 咪达唑仑;mi-214;丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(EK)-环磷腺苷效应元件结合蛋白(CEB);海马神经元;增殖;凋亡中图分类号 285.5 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0739-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.056通信作者:张如意(1977-)，男，硕士，副主任医师，主要从事危重患者麻醉与脏器保护研究。第一作者:舒蕤(
6、1985-)，女，硕士，主治医师，主要从事危重患者麻醉与脏器保护研究。脑缺血再灌注损伤是临床常见的一种病理过程，海马神经元细胞增殖、凋亡异常是脑缺血再灌注损伤发生的重要原因之一，因而如何减轻脑缺血再灌注损伤成为研究重点1 3。咪达唑仑属于 氨基丁酸受体激动剂，其具有镇静、抗焦虑等作用，咪达唑仑通过激活 c-Jun 氨基末端激酶(JNK)-细胞外调节蛋白激酶(EK)途径而抑制氧化应激诱导的神经元细胞凋亡从而减轻细胞损伤4。但咪达唑仑对缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞损伤的影响及其可能作用机制尚未阐明。mi-214-3p 在阿尔茨海默病中表达水平降低，并可通过抑制自噬而减轻认知障碍5。mi-214
7、 可调控丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/EK信号通路而参与口腔癌的发生过程，已有研究表明MAPK/EK-环磷腺苷效应元件结合蛋白(CEB)通路被激活后可促进海马神经元细胞凋亡而造成细胞损伤6，7。但咪达唑仑是否可通过调控 mi-214/MAPK/EK-CEB 通路而减轻脑缺血再灌注损伤尚未可知。本研究采用缺氧复氧诱导大鼠海马神经元细胞建立细胞损伤模型，探讨咪达唑仑对缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元细胞增殖、凋亡的影响及其对mi-214/MAPK/EK-CEB 通路的调控作用。1材料与方法1.1材料与试剂咪达唑仑购自江苏恩华药业股份有限公司;大鼠海马神经元细胞购自美国模式菌种收集中心(ATCC)细胞
8、库;DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司;Lipofectamine2000、凋亡检测试剂购自北京索莱宝科技有限公司;MAPK/EK-CEB 通路抑制剂 PD98059(母液 20 mg/ml)购自碧云天生物技术研究所;anti-mi-con、anti-mi-214 购自广州锐博生物科技有限公司;噻唑蓝(MTT)试剂购自广州劳斯生物科技有限公司;Trizol 试剂购自美国 In-vitrogen 公司;反转录试剂盒、SYB Green 试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;兔抗鼠、B 细胞淋巴937舒蕤等咪达唑仑调控 mi-214/MAPK/EK-CEB 通路对缺氧复氧诱导的大鼠海马神经元
9、细胞增殖及凋亡的影响第 3 期瘤(Bcl)-2、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bax)抗体购自美国Santa Cruz 公司;兔抗鼠 MAPK、p-EK、p-CEB 抗体与 IgG 二抗购自美国 Abcam 公司。1.2实验分组大鼠海马神经元细胞置于密闭缺氧的培养箱内(95%N2、5%CO2)缺氧处理 4 h，将其转移至 37、体积分数 5%CO2正常培养箱复氧处理 24 h8，记为缺氧复氧组。同时将正常培养的细胞记为 NC 组。大鼠海马神经元细胞加入含有不同浓度(3、6、12 mol/ml)咪达唑仑的培养基处理24 h 后 进 行 缺 氧 复 氧 处 理9，分 别 记 为 3、6、12 mol
10、/ml咪达唑仑+缺氧复氧组。anti-mi-con、anti-mi-214 分别转染入大鼠海马神经元细胞后加入12 mol/ml咪达唑仑处理 24 h 后进行缺氧复氧处理，分别记为 12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-mi-con 组、12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-mi-214 组。anti-mi-214 转染入大鼠海马神经元细胞后加入12 mol/ml 咪达唑仑与50 mol/L抑制剂 PD98059 处理 24 h 后进行缺氧复氧处理10，记为 PD98059+12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧+anti-mi-214 组。1.3MTT 检测细胞增殖收
11、集各组海马神经元细胞接种于 96 孔板(150 l/孔)，每孔加入质量浓度为 5 mg/ml 的 MTT 溶液20 l，继续培养4 h 后弃上清，加入 150 l DMSO，室温避光振荡孵育 5 min 后应用酶标仪检测各孔吸光度值(A 值)。1.4流式细胞术检测细胞凋亡率收集各组海马神经元细胞加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后弃上清，将 500 l 结合缓冲液加入细胞沉淀后分别加入 5 l 膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)与 5 l 碘化丙啶(PI)，振荡摇晃孵育 10 min后应用 FACS Calibur 流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.5实时荧光定量(qT)
12、-聚合酶链反应(PC)检测细胞中 mi-214 的表达水平收集各组海马神经元细胞后采用 Trizol 法提取 NA，反转录合成 cD-NA，PC 扩增反应体系:SYB Green Master Mix10 l，正反向引物 0.8 l，cDNA 2 l，ddH2O 补足体系至 20 l;反应条件:95预变性 2 min，95变性30 s，60退火30 s，72延伸30 s，共40 次循环。采用 2Ct法计算 mi-214 相对表达量。1.6Western 印迹检测 MAPK、p-EK、p-CEB、Bax、Bcl-2 蛋白表达提取各组海马神经元细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，十二烷
13、基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后使用 5%脱脂奶粉封闭 2 h，4 条件下孵育一抗稀释液(1 1 000)过夜，TBST 洗涤，室温条件下孵育二抗稀释液(1 2 000)1 h，滴加电化学发光(ECL)显影，应用 ImageJ 软件分析各条带灰度值。1.7统计学处理采用 SPSS21.0 软件进行独立样本 t 检验、单因素方差分析。2结果2.1不同浓度咪达唑仑对缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞活性的影响与 NC 组比较，缺氧复氧组细胞活力明显降低(P0.05);与缺氧复氧组比较，3、6、12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧
14、复氧组细胞活力明显升高(P0.05)。见表 1。2.2不同浓度咪达唑仑对缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞凋亡的影响与 NC 组比较，缺氧复氧组细胞凋亡率明显升高，Bax 蛋白水平明显升高，Bcl-2 蛋白水平明显降低(P0.05);与缺氧复氧组比较，3、6、12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组细胞凋亡率明显降低，Bax 蛋白水平明显降低，Bcl-2 蛋白水平明显升高(P0.05)。见表 1、图 1、图 2。2.3不同浓度咪达唑仑对缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞中 mi-214 表达水平的影响与 NC组比较，缺氧复氧组 mi-214 的表达水平明显降低(P0.05);与缺氧复氧组比较，3、
15、6、12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组 mi-214 表达水平明显升高(P0.05)。见表 1。表 1不同浓度咪达唑仑对缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞活性、凋亡和细胞中 mi-214 表达水平的影响(xs，n=9)组别A 值BaxBcl-2凋亡率(%)mi-214对照组0.8390.060.320.030.860.077.210.431.000.07缺氧复氧组0.4380.031)0.810.051)0.390.021)23.512.041)0.380.021)3 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组0.5940.052)0.720.062)0.490.032)18.461.362)0.
16、520.032)6 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组0.7250.062)0.590.032)0.650.052)13.061.022)0.680.052)12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组0.8130.072)0.350.022)0.800.072)9.020.822)0.860.062)F 值80.520258.452131.592258.604228.732P 值0.0000.0000.0000.0000.000与 NC 组比较:1)P0.05;与缺氧复氧组比较:2)P0.05047中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷1 5:对照组、缺氧复氧组、3 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组、6 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组、12 mol/ml 咪达唑仑+缺氧复氧组;图 2 同图 1流式细胞仪检测各组细胞凋亡图 2Western 印迹检测各组 Bax、Bcl-2 蛋白表达2.4下调 mi-214 表达抑制咪达唑仑对缺氧复氧处理的大鼠海马神经元细胞的影响与 12 mol/ml咪 达 唑 仑+缺 氧 复 氧+anti-mi-con 组 比 较，12 mol/ml 咪