1、山东医药2023 年第 63 卷第 3 期乔松素对缺氧/复氧诱导大鼠心肌细胞焦亡的预防作用及其机制张威，卢小伟，许浩湖北医药学院附属国药东风总医院心血管内科，湖北十堰442008摘要：目的观察乔松素（PIN）对缺氧/复氧（H/R）诱导的大鼠心肌细胞焦亡的预防作用，并探讨其预防作用机制。方法将大鼠心肌细胞H9c2分为PIN-H+740-Y-P组、PIN-H组、PIN-L组、模型组、对照组。PIN-H+740-Y-P组用加入25 mol/L PIN+50 g/mL 740-Y-P的培养基、PIN-H组用加入25 mol/L PIN的培养基、PIN-L组用加入12.5 mol/L PIN的培养基、模
2、型组用空白培养基培养1 h之后进行H/R处理。对照组仅用空白培养基培养。取上述各组细胞继续培养24、48、72 h，采用CCK-8法测定细胞活力；取上述各组细胞，采用碘化吡啶（PI）染色法测算各组心肌细胞焦亡比例，ELISA法测定细胞中LDH，Western blotting法检测细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、核因子-B（NF-B）蛋白和细胞焦亡相关蛋白（Caspase-1、ASC和NLRP3蛋白），荧光定量PCR法测定细胞中PI3K、AKT、NF-B mRNA。结果与对照组相比，模型组细胞活力（48 h、72 h）下降（P均0.05）；焦亡心肌细胞比例，LDH水
3、平，Caspase-1、ASC和 NLRP3蛋白相对表达量，PI3K、Akt、NF-B p65蛋白的磷酸化水平及 PI3K、Akt、NF-B mRNA相对表达量升高（P均0.05）。与模型组相比，PIN-H组细胞活力（48 h、72 h）上升（P均0.05）；心肌细胞焦亡比例，LDH水平，Caspase-1、ASC和NLRP3蛋白相对表达量，PI3K、Akt、NF-B p65蛋白的磷酸化水平及PI3K、Akt、NF-B mRNA相对表达量下降（P均0.05）。与PIN-H组比较，PIN-H+740-Y-P组细胞活力降低，心肌细胞焦亡比例，LDH水平，Caspase-1、ASC、NLRP3蛋白相
4、对表达量，PI3K、AKT、NF-B p65蛋白磷酸化水平及PI3K、AKT和NF-B mRNA相对表达量升高（P均0.05）。结论PIN对 H/R诱导的心肌细胞焦亡有预防作用，其作用机制可能是通过下调PI3K/AKT/NF-B信号通路实现。关键词：乔松素；细胞焦亡；心肌细胞焦亡；磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核因子-B信号通路；缺氧/复氧doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.03.003 中图分类号：R364.1 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）03-0012-05Pinocembrin inhibits cardiomyocyte p
5、yroptosis induced by hypoxia/reoxygenation in ratsZHANG Wei，LU Xiaowei，XU HaoDepartment of Cardiovascular Medicine，Sinopharm Dongfeng General Hospital Affiliated to Hubei Medical College，Shiyan 442008，ChinaAbstract：Objective To observe the preventive effect of pinocembrin（PIN）on myocardial cell deat
6、h induced by hypoxia/reoxygenation（H/R）in rats，and to explore its preventive mechanism.Methods The rat cardiomyocytes H9c2 were divided into PIN-H+740-Y-P group，PIN-H group，PIN-L group，model group，and control group.H9c2 cells in the PIN-H+740-Y-P group were incubated with medium including 25 mol/L P
7、IN and 50 g/mL 740-Y-P，PIN-H group with medium including 25 mol/L PIN，PIN-L group with medium including 12.5 mol/L PIN and model group with blank medium for 1 h and then followed by H/R treatment.H9c2 cells in the control group were only cultured with blank medium.The cells of the above groups were
8、cultured for 24，48 and 72 h，and the cell viability was determined by CCK-8.We took the cells of the above groups，measured the proportion of myocardial cells in each group by pyridine iodide（PI）staining，and measured the LDH in the cells by ELISA，and detected the phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K），pr
9、otein kinase B（AKT）and nuclear factor-B（NF-B）protein，and pyrolytic related proteins Caspase-1，apoptosis-associated speck-like protein containing CARD（ASC）and NOD-like receptor protein 3（NLRP3）proteins in the cells by Western blotting.PI3K，AKT and NF-B mRNA in cells were determined by fluorescence qu
10、antitative PCR.Results Compared with the control group，the cell viability（at 48 and 72 h）decreased（P0.05），but the cardiomyocyte pyroptosis ratio，LDH level，PI3K，Akt and NF-B mRNA expression levels，PI3K，Akt，NF-B p65 protein phosphorylation levels，Caspase-1，ASC and NLRP3 protein expression levels incre
11、ased in the H/R group（all P0.05）.Compared with the model group，the cell viability increased（at 48 and 72 h）（P0.05），but the proportion of myocardial cell 12山东医药2023 年第 63 卷第 3 期death，the level of LDH，the relative expression levels of Caspase-1，ASC and NLRP3 proteins，the phosphorylation levels of PI3K
12、，Akt and NF-B p65 proteins and the relative expression levels of PI3K，Akt and NF-B mRNA decreased in the PIN-H group（all P0.05）.Compared with the PIN-H group，the cell viability decreased，but the proportion of myocardial cell death，the level of LDH，the relative expression levels of Caspase-1，ASC，NLRP
13、3 proteins，the phosphorylation levels of PI3K，AKT，NF-B p65 protein and the relative mRNA expression levels of PI3K，AKT and NF-B increased in the PIN-H+740-Y-P group（all P99%）购自于武汉科斯坦生物科技有限公司；高糖 DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司（美国）；青霉素-链霉素混合液、CCK-8试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；PI、Hoechst
14、 33342、BCA蛋白定量试剂盒、PI3K、AKT、NF-B、p-PI3K、p-AKT、p-NF-B p65、Caspase-1、ASC、NLRP3 一抗及其相应二抗购自 Sigma 公司（美国）；PI3K激活剂740-Y-P购自Selleck公司。仪器：全自动酶标仪（F.A.M.E.16/20型）购自瑞士哈美顿公司；全自动化学发光凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；荧光显微镜购自德国Leica公司；荧光定量PCR仪购自北京安诺伦生物科技有限公司。1.2H9c2 细胞分组、PIN 的加入、H/R 处理、将H9c2细胞随机分为PIN-H+740-Y-P组（25 mol/L PIN+50 g
15、/mL 740-Y-P8）、PIN-H 组（25 mol/L PIN 9）、PIN-L组（12.5 mol/L PIN）、模型组、对照组。对照组细胞的培养条件如1.1所述。其余各组细胞加入相应浓度的药物共同孵育1 h，之后进行H/R处理。根据参考文献 10，首先对细胞培养基进行处理。取无糖无血清的DMEM培养基，将其置于37 的低氧培养箱中，混合通入流速为2 L/min的95%N2和5%CO2气体3 h。之后将H9c2细胞原有的培养基迅速换成上述处理好的DMEM培养基，并放在低氧培养箱中继续培养12 h。之后重新将培养基置换为含 10%胎牛血清的高糖 DMEM 培养基，在温度37、CO2体积分
16、数5%的细胞培养箱中继续培养4 h。1.3H9c2 细胞的活力检测采用 CCK-8 法。将1.2所述的各组细胞继续培养24 h、48 h、72 h后每孔中加入10 L CCK-8试剂，继续培养2 h后，在酶标仪450 nm下测定每孔的吸光度（OD450值）。1.4各组焦亡心肌细胞的比例测算采用PI染色法。将1.2所述的各组细胞的培养基弃去，加入细胞染色缓冲液0.1 mL，加入Hoechst染色液和PI染色液各 5 L，轻轻晃匀，在 4 环境下避光孵育13山东医药2023 年第 63 卷第 3 期0.5 h。孵育结束后用PBS洗涤，在荧光显微镜下观察细胞染色结果。Hoechst染色结果阳性细胞呈蓝色，PI染色阳性细胞呈红色。PI阳性表示细胞出现焦亡。结果用PI阳性细胞比例表示。1.5各组H9c2细胞中LDH检测采用ELISA法。将1.2所述的各组细胞继续培养24 h后，离心后取上清液。按照LDH试剂盒的说明书操作，测定H9c2细胞中的LDH。1.6各组H9c2细胞中PI3K/AKT/NF-B信号通路和细胞焦亡相关蛋白检测采用Western blotting法检测。取1.2所述的各组细胞，