1、河南农业科学，2023，52（1）：125133Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi：10.15933/ki.10043268.2023.01.013青花菜花蕾发育LncRNAs内参基因筛选裴徐梨1，冯鹏宇1，唐征2，李亚梅1，焦鹏1，荆赞革1，2（1.昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214；2.温州科技职业学院 农业与生物技术学院，浙江 温州 325006）摘要：在分析青花菜花蕾发育过程长链非编码RNA（LncRNAs）的表达中，筛选稳定表达的内参基因至关重要。通过前期高通量测序筛选出16个候选内参基因，利用qRT-PCR技术检测
2、其表达水平，并结合geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个软件对16个LncRNAs在青花菜花蕾不同部位和不同发育时期的表达稳定性进行分析。结果表明，在花蕾不同部位中，geNorm算法认为XLOC_000400、XLOC_008536、XLOC_034059为最适内参基因；NormFinder计算XLOC_021473、XLOC_000400、XLOC_034059为最佳内参基因；BestKeeper显示XLOC_025578表达最稳定。在花蕾不同发育时期中，geNorm算法认为XLOC_000108、XLOC_039609、XLOC_021473为最适内参基因；Norm
3、Finder计算 XLOC_021473、XLOC_039609、XLOC_000108为最佳内参基因；BestKeeper显示XLOC_034059表达最稳定。综合评估后，在花蕾不同部位和不同发育时期中适宜的内参基因对分别为 XLOC_000400/XLOC_008536 和 XLOC_039609/XLOC_021473。关键词：青花菜；内参基因；长链非编码RNA；花蕾中图分类号：S635.9文献标志码：A文章编号：1004-3268（2023）01-0125-09Selection of LncRNAs Reference Genes in Development of FlowerBu
4、d in BroccoliPEI Xuli1，FENG Pengyu1，TANG Zheng2，LI Yamei1，JIAO Peng1，JING Zange1，2（1.College of Agriculture and Life Sciences，Kunming University，Kunming 650214，China；2.College of Agriculture andBiotechnology，Wenzhou Vocational College of Science and Technology，Wenzhou 325006，China）Abstract：In order
5、to preliminarily analyze the expression of LncRNAs during the flower bud developmentof broccoli，it is very important to screen the stably expressed internal reference genes.In this study，16candidate internal reference genes were screened by highthroughput sequencing.The expression levelswere detecte
6、d by qRTPCR.And the expression stability of 16 LncRNAs in different parts and differentdevelopmental stages of broccoli flower bud was analyzed by geNorm，NormFinder and BestKeepersoftwares.The results showed that in different parts of bud，geNorm demonstrated that XLOC_000400，XLOC_008536 and XLOC_034
7、059 were suitable reference genes；NormFinder recommended XLOC_021473，XLOC_000400 and XLOC_034059 as reference genes；BestKeeper showed that the expression ofXLOC_025578 was the most stable.In different bud development stages，geNorm demonstrated thatXLOC_000108，XLOC_039609andXLOC_021473weresuitableref
8、erencegenes；NormFinder收稿日期：2022-09-21基金项目：云南省地方本科高校（部分）基础研究联合专项（2018FH001-044）；浙江省自然科学基金项目（LY18C150006）；浙江省农业（蔬菜新品种选育）新品种选育重大科技专项子项目（2021C02065-4-2）；温州市科技项目（2019ZX007-2）；浙江省教育厅一般项目（Y202045786）作者简介：裴徐梨（1990-），女，云南昭通人，讲师，博士，主要从事蔬菜分子生物学研究。E-mail：xuliP通信作者：荆赞革（1983-），男，河南灵宝人，副研究员，博士，主要从事蔬菜分子生物学研究。E-mail
9、：河南农业科学第 52 卷表116个候选LncRNAs引物序列及相关数据Tab.1Primer sequences and related data of 16 candidate LncRNAsXLOC_000108XLOC_000400XLOC_007087XLOC_007980XLOC_008536XLOC_010342AGCCTCTGATGATGATGATCAGCCAACACGAAACTATTTCTTTCTCTTCGGCGTAGACACTCCACTCACAGATGCTCGCACAAGAAGAAGTAATACCTCCTTGGCTTAGAACCTCTTGTATCGTGCTTCCTTCTGT
10、TGTATCAGGTTGTGTAAGATGGACCTTGGAGATGTAAGTCAACAGAGGCGATTGTAACGCTATGTGTTGTGATCCTAACCTCCCAGAATCG1401351301491281270.9910.9810.9540.9930.9830.992基因名称Gene name引物序列（53）Primer sequences（53）扩增长度/bpAmplicon length扩增效率/%Amplification efficiencyrecommended XLOC_021473，XLOC_039609 and XLOC_000108 as reference gen
11、es；BestKeepershowed that the expression of XLOC_034059 was the most stable.After a comprehensive evaluation，XLOC_000400/XLOC_008536 and XLOC_039609/XLOC_021473 were the most stable reference genesfor different parts and different developmental stages，respectively.Key words：Broccoli；Reference gene；Lo
12、ng noncoding RNA；Flower bud长 链 非 编 码 RNA（Long noncoding RNAs，LncRNAs）是一类长度超过200 bp的转录本1，其在调控下游基因表达、增强mRNA稳定性和调节蛋白质活性等生理活动中发挥着重要作用23。目前，已在 水 稻（Oryza sativa L.）4、拟 南 芥（Arabidopsisthaliana L.）5、白菜（Brassica pekinensis L.）6、黄瓜（Cucumis sativus L.）3和木本植物如樱桃（Cerasuspseudocerasus L.）7、葡萄（Vitis vinifera L.）1等
13、物种中鉴定出大量的 LncRNAs。LncRNAs 具有保守性低、表达量低和组织特异性强等特点28。例如，茄科 中 LncRNAs 的 序 列 分 析 表 明，不 同 物 种 中LncRNAs的序列保守性很低。LncRNA-314在普通番茄和醋栗番茄中有特异性表达，而在潘那利番茄中则没有表达9。水稻LncRNAs的全基因组鉴定和分析表明，与哺乳动物相比，LncRNAs表达具有较高的组织特异性或阶段特异性4。青花菜（Brassicaoleracea var.italica）主要可食用部分为绿色花球，由肉质花茎和小花梗及绿色的花蕾群所组成8。花蕾的 发 育 与 青 花 菜 的 外 观 品 质 密
14、切 相 关。而LncRNAs 在花蕾发育过程中起着重要的调控作用610。本研究通过前期的青花菜全基因组高通量测序选取了16个LncRNAs作为候选内参基因。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件评估其在花蕾不同部位和不同发育时期中的表达稳定性，筛选适宜的内参基因，为进一步准确定量分析青花菜花蕾LncRNAs表达水平提供适宜内参。1材料和方法1.1材料以青花菜高代自交系KU19-3为材料，于开花期采集花蕾。花蕾不同部位分别为花梗、花萼、花瓣、雌蕊和雄蕊；花蕾发育分为6个时期，长度分别为1、2、3、4、5、6 mm。1.2方法1.2.1RNA 提取与 cDNA 合成青花菜
15、总 RNA 的提取按照植物 RNA 提取试剂盒宝日医生物技术（北京）有限公司操作说明书进行。质量检测合格后，反转录合成cDNA第1链。1.2.2内参基因的选择与qRT-PCR引物设计在前期高通量测序的基础上，筛选了16个在细胞质雄性不育系及其保持系中表达相对稳定的LncRNAs（XLOC_000108、XLOC_000400、XLOC_007087、XLOC_008536、XLOC_008536、XLOC_010342、XLOC_012179、XLOC_015579、XLOC_021473、XLOC_025578、XLOC_029328、XLOC_030832、XLOC_034059、XLOC
16、_034687、XLOC_037050和XLOC_039609）作为青花菜花蕾不同部位和不同发育时期的候选内参基因，各自引物序列见表1。126第 1 期1.2.3候选内参基因qRT-PCR扩增qRT-PCR在ABI 7500上进行，反应体系和程序参照裴徐梨等11的方法。扩增反应结束后观察溶解曲线，检测引物的特异性。1.2.4标准曲线的绘制将cDNA模板依次稀释10倍得到5个梯度（1、10-1、10-2、10-3、10-4）。根据PCR得到的反应结果绘制标准曲线，并计算扩增效率（E），E=（10-1/slope-1）100%，slope 为 标 准 曲 线 的斜率。1.3数据处理与分析利用 geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 软件对候选内参LncRNAs进行数据处理和分析。geNorm和NormFinder软件需先将平均循环阈值（Ct）转换为相对表达量 Q 值（Q=E-Ct）才能进行数据输入，BestKeeper软件可以直接输入qRT-PCR得到的Ct值9。将3个软件分别输出的平均表达稳定值M和S、标准差SD值进行表达稳定性排名，并对其求平均得出综合排名。2结果