1、 中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 Chin J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 433 论 著 人脐带间充质干细胞外泌体的鉴定及其作用于肺动脉高压的生物信息学分析 吴璐瑶1,2，黎伟文1,2，肖梦媛1，邓少东2,3*，陈建英1*(1.广东医科大学附属医院，广东 湛江 524001；2.广东医科大学第二临床医学院，广东 东莞 523808；3.广东医科大学附属东莞第一医院，广东 东莞 523710)摘要：目的 探讨人脐带间充质干细胞外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem c
2、ell exosomes，hUCMSC-Exo)缓解肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)的潜在分子作用机制。方法 对 hUCMSC-Exo 进行提取、鉴定及高通量测序。利用 GeneCards 搜索 PH 作用靶点，在 GEO 数据库下载 PH 相关芯片(GSE53408、GSE113439)，经过批次校正后筛选出差异基因。GeneCards 和 GEO 数据库以及 hUCMSC-Exo 所含 miRNAs 预测的靶向调控的 mRNAs 取交集，构建蛋白互作网络筛选出 hUCMSC-Exo 作用于 PH 的关键靶点，并进行 GO 和 KEGG 富集分析。结果 测序得
3、到 hUCMSC-Exo 中 43个高表达的 miRNAs，其中 17 个 miRNAs 可作用于 PH，发现其作用机制可能与前列腺癌、HIF-1 信号通路、PI3K-Akt信号通路、癌症的蛋白多糖和癌症通路等相关。结论 本研究可为 hUCMSC-Exo 防治 PH 的临床研究提供新思路。关键词：肺动脉高压；人脐带间充质干细胞外泌体；外泌体测序；生物信息学 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2023)04-0433-10 DOI:10.13748/ki.issn1007-7693.2023.04.001 引用本文：吴璐瑶,黎伟文,肖梦媛,等.人脐带间充质干
4、细胞外泌体的鉴定及其作用于肺动脉高压的生物信息学分析J.中国现代应用药学,2023,40(4):433-442.Identification of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Exosomes and Bioinformatics Analysis of Their Effects on Pulmonary Hypertension WU Luyao1,2,LI Weiwen1,2,XIAO Mengyuan1,DENG Shaodong2,3*,CHEN Jianying1*(1.The Affiliated Hospital of
5、Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,China;2.The Second Clinical Medical College,Guangdong Medical University,Dongguan 523808,China;3.The First Dongguan Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Dongguan 523710,China)ABSTRACT:OBJECTIVE To explore the potential molecular mechanism
6、of human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes(hUCMSC-Exo)in alleviating pulmonary hypertension(PH).METHODS The hUCMSC-Exo were high-throughput sequenced after extracted and identified.PH target was searched in GeneCards.PH-related chip GSE53408 and GSE113439 were downloaded from GEO databas
7、es and screened for the differential genes after batch correction.The target genes in GeneCards and GEO databases and the target regulated genes predicted by miRNAs contained in hUCMSC-Exo were used for intersection.The protein-protein interaction network was constructed to screen out the key target
8、s of hUCMSC-Exo acting on PH,then went for GO and KEGG analysis.RESULTS Forty-three high expression miRNAs were collected after hUCMSC-Exo sequenced.A total of 17 miRNAs might affect PH through prostate cancer,HIF-1 signaling pathway,PI3K-Akt signaling pathway,proteoglycans in cancer and pathways in
9、 cancer.CONCLUSION This study provides a new idea for exploring the role of hUCMSC-Exo in alleviating PH.KEYWORDS:pulmonary hypertension(PH);human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes(hUCMSC-Exo);exosome sequencing;bioinformatics 基金项目：国家自然科学基金项目(81370242)；广东医科大学学科建设项目(4SG21229GDGFY01，4SG210
10、08G)；广东医科大学校级大学生创新创业训练计划项目(GDMU2021117，GDMU2021156)；广东医科大学附属医院干细胞临床前研究项目(2018PSSC006)；湛江市科技计划项目(2021B01145)；广东医科大学青年科研培育基金项目(GDMUQ2021011)作者简介：吴璐瑶，女，硕士生 E-mail: *通信作者：陈建英，男，硕士，主任医师 E-mail: 邓少东，男，博士，讲师 E-mail: 肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是由多种病因及不同的发病机制导致的肺血管结构或功能改变，常引起肺血管阻力和肺动脉压力升高，继而发展成为右心功能衰竭，预
11、后极差1。目前，434 Chin J Mod Appl Pharm,2023 February,Vol.40 No.4 中国现代应用药学 2023 年 2 月第 40 卷第 4 期 PH 的发病机制尚未完全明确，涉及组织、细胞、分子介质及遗传基因等多个层次，与血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞和循环内皮祖细胞等多种细胞相关联。PH 引起肺血管平滑肌的增殖、重构，内皮炎症及向间质转化。在分子层面，涉及 miRNA、趋化因子、低氧诱导因子、GTP结合蛋白等多种基因产物的调控，目前 PH 仍然缺乏有效的生物标志物2。治疗 PH 的药物主要包括钙离子通道阻滞剂、前列腺素、内皮素受体拮抗剂、磷酸二
12、酯酶抑制剂和可溶性鸟苷酸环化酶激动剂，这些药物可以提高患者运动能力、生活质量和改善肺血液循环，但是无法治愈 PH 且预后依然很差。间充质干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的非造血祖细胞，可以从组织中分离出来，间充质干细胞具有修复损伤和参与免疫调节的作用，已有相关研究将间充质干细胞运用到疾病治疗中。同时，间充质干细胞具有多向分化的潜能，间充质干细胞注入 PH 大鼠后，在肺组织中可发现类软骨细胞及类肾小囊细胞等，存在极大的安全隐患。同时，干细胞移植治疗还存在存活率低、分化率低等不足，极大地限制了间充质干细胞等干细胞的临床应用，因此研究者们将目光投向外泌体。外泌体是通过多泡体与质膜融合进入细
13、胞外环境而释放的一种微粒，可作为细胞与细胞之间沟通的桥梁，传递各种具有其来源细胞的成分，如 mRNA、miRNA、营养因子及功能蛋白等。外泌体中携带的 miRNAs 可能会引起受体细胞中一系列信号通路的启动，基因的调控及相关蛋白的表达。笔者所在课题组前期研究显示外泌体可以通过调节肾素-血管紧张素系统预防大鼠急性心肌梗死3。miRNA 是一类由 1925 个核苷酸组成的小型非编码 RNA，在转录后通过靶向 mRNA 调控基因的表达，成熟的 miRNA 在细胞核内经过转录和处理，通过与 mRNA 的非翻译区相互作用，下调特定靶向 mRNA 的表达，最终通过降解靶向 mRNA或抑制其翻译调控转录后基
14、因的表达。有研究表明，miRNA 参与调控 PH 过程中的肺动脉内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞的功能从而影响肺血管重构。在调控肺动脉内皮细胞功能中，miR-98 可以被过氧化物酶体增殖物激活的受体-调节，并减弱内皮素-1 的表达和肺血管重塑4。在调控肺动脉平滑肌细胞的代谢中，过表达的 miR-let-7b 通过靶向血管紧张素转换酶-2 来刺激肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移5。为此，本研究采用人脐带间充质干细胞外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes，hUCMSC-Exo)，对提取的外泌体进行鉴定和高通量测序，分析其含有的高表达的m
15、iRNAs，并结合 PH 靶基因进行分析，探讨hUCMSC-Exo 改善 PH 的潜在分子作用机制。1 材料与方法 1.1 仪器 NovoCyte 260R 流式细胞仪(艾森生物杭州有限 公 司)；Optima XPN-100超 高 速 离 心 机(BECKMAN)；1658033 型电泳仪(美国 Bio-Rad)；JEM1230 透射电子显微镜(日本电子株式会社)；铜网(TED pella)；ZetaView 纳米粒径仪(德国 Particle Metrix)；Hiseq 2 000/2 500高 通 量 测 序 仪(Illumina)。1.2 试剂-MEM 培养基(Gibco，批号：C12
16、571500BT)；人脐带间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒(货号：HUXUC-90031)、人脐带间充质干细胞成骨诱导分化 试 剂 盒(货 号：HUXUC-90021)均 购 自 美 国Cyagen；HLA-DR FITC(货号：327005)、CD105 APC(货号：323207)、CD90 FITC(货号：328107)、CD73 FITC(货号：344015)、CD45 PerCP(货号：304025)、CD34 PE(货 号：343505)均 购 自Biolegend；2%磷钨酸溶液(北京索莱宝科技有限公司，货号：G1871)；CD9 抗体(货号：ab263019)、CD63 抗体(货号：ab134045)、calnexin 抗体(货号：ab133615)、HSP70 抗体(货号：ab181606)、TSG101抗体(货号：ab125011)均购自 Abcam；TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina，San Diego，货号：RS-200-0024)。1.3 外泌体的提取、鉴定与分析 1.3.1 人脐带间充质干细胞的培养与鉴定 脐带