1、第 1 期第 53 卷工业微生物乳酸菌富集培养与冻干技术研究进展黄若辰1，钟 昊1，李君梅1，2，张 鑫2，3，徐红艳1，刘笑笑1,2，3*1.延边大学，吉林 延吉 136200；2.吉林省农业科学院，吉林 长春 130033；3.吉林省肉用草食家畜生产技术国际联合研究中心，吉林 长春 130033摘要：乳酸菌属于益生菌，对人体的健康十分有益。但使用常规方法来培养乳酸菌，其活菌数量较低，而富集培养是提高微生物产量的有效途径和手段，冻干技术可以用于制备高浓度的乳酸菌菌粉。文章对近年来乳酸菌富集培养技术与冻干方法等方面的研究进展进行分析，并进行了详细阐述。关键词：乳酸菌；富集培养；真空冷冻干燥；方
2、法条件基金项目：吉林省农业科技创新工程项目（CXGC2021ZYD123）；吉林省科技厅技术创新引导项目（20220404009NC）作者简介：黄若辰（2000.02），女，汉族，吉林长春人，在读硕士，研究方向：食品微生物发酵研究。E-mail:。*通信作者：刘笑笑（1984.02），女，满族，吉林通化人，硕士，副研究员，硕士生导师，研究方向：食品微生物发酵研究、畜产品质量安全与品质评价研究。E-mail:。doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.01.002乳酸杆菌是一种天然的有益微生物品，在厌氧条件下能利用葡萄糖等碳水化合物发酵并且产生大量乳酸菌。绝大部分乳酸菌
3、为厌氧或兼性厌氧的化能异养菌，其必须处在酸性或微酸性的环境中才能生长，并且不能构成芽孢1。部分乳酸菌的功能强大，可以提升免疫力、治疗胃肠道相关疾病以及舒缓精神类疾病。富集培养在微生物学中是一种作用较强的技术方式，其能培育出很高含量活菌的菌悬液。可以从微生物混合群开始，不断增加特定菌种的数量，引导纯培养的有效培养手段。富集培养的管控主要依赖生理要素，例如氮源、碳源、温度、pH 和需氧量等1。冻干技术（freeze drying technology）是保存微生物的一大手段，利用冷冻干燥法研制的微生物发酵剂包含的活菌数较多，并且便于存储和运输，是发酵剂的主要制备手段，有助于乳酸菌菌剂在长久存储的过
4、程中维持生物活性、稳定性2。1乳酸菌富集培养富集培养指的是自微生物混合群起，不断提升特定菌种的数量，引向纯培养的手段。在现实生产过程中可以削减菌悬液的运用数量，削减运输成本。在培养乳酸菌的过程中，培育时间、培养 pH、培养基的构成等要素会对菌体细胞的生理状况产生影响，控制相应的培育条件对菌体的存活率、抗冻干能力具有一定的积极意义3。1.1培养基的成分通常，在配制培养基时，要确保基质的质量，才能使其在一定范围内成长，而基质的浓度过高或过低都会对微生物的生长造成不良影响，因此在培植过程中应选用适宜的基质。陈雪等4运用响应面法来明确最佳增菌培养基：碳酸钙 5.57 g/L、酶水解酪蛋白 8.74 g
5、/L 给、酵母粉9.80 g/L。田文等5通过调研指出，混合马铃薯汁、番茄汁以及胡萝卜汁等中的活菌数超过 109CFU/mL。乳清蛋白对保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌等常见的生长繁殖型乳杆菌均有一定作用。Bury6的研究结果表明，在加入 1%至 2%的乳清蛋白后，保加利亚乳杆菌和嗜热型链球菌的生长速度均较高。结果表明：含有寡糖的菊芋果汁和大麦中的多糖组分能有效增加双歧细菌的活性。1.2培养条件1.2.1pH增大环境的 pH 对积累乳酸菌十分重要，可以第 53 卷第 1 期2023 年 2 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.1Feb.20234
6、-第 1 期第 53 卷在培养液中加入含磷的缓冲液或碳酸钙，也可以用碱性溶液直接中和。姜铁民等7使用化学中和方法将该培养液的 pH设为 5.8，并与细菌数和镜检查结果相比，最后检验获取了乳酸菌活菌数，高达 3.21010CFU/mL。Bai 等8借助 25 mL/h 的流加速度培育 L.lactis BME5-18M，pH为 6.5 时，获取的细胞浓度相对较高，生产的乳酸菌数量较大。万红兵等9通过对保加利亚乳酸菌、西红柿混合汁发酵液等进行观察，发现加入碳酸钙可以中和细菌生成的酸性物质，而少量 Ca2+对冷冻干燥有一定防护作用。碳酸与有机酸发生化学反应，生成 CO2，对一些乳杆菌而言具有促进生长
7、的效果。1.2.2温度各个菌株对温度的要求具有很大差别，并且发酵温度会显著影响菌体的生长发育，所以应先确定菌种的最适生长温度，并在此条件下进行相关实验。李志成等10将脱脂乳当成基础培养基，选择两类混合菌种、不同的发酵温度发酵，冷冻干燥，因其发酵的温度差异较大，30下的冷冻干燥发酵液中含有最多细菌。1.3菌体细胞分离浓缩乳酸菌在富集培养之后，采用正确的方式将菌种从培养基中采集出来，然后进行浓缩，除去代谢产物，制作出适宜于真空冷冻的悬浮液。目前，微生物的分离和富集方法主要有两种：离心和超滤。王建等11通过对大量实验进行总结，得出了最佳的菌体离心浓缩工艺条件，即将发酵液的 pH 控制在 7.5，离心
8、速率控制在 1 000 r/min，在这一条件下可以显著提升菌体的收获率。张建友等12综合运用超滤法、离心法浓缩菌体，选取最好工艺：超滤法是前期处理的关键方式，能够满足最佳的离心条件：菌株和细菌的最佳离心工艺为 6 000 r/min。结合当前的调研，离心方法简单，便于落实，能够对菌体组织进行有效处理，适用于工业化生产。2冻干技术2.1技术方法真空冷冻干燥原理是在真空条件下，将高密度的乳酸菌悬浊物进行离心，添加抗冻保护剂，预先经过超低温，一般处理为冻结状态，浓缩微生物细胞直接升华，干燥至粉末。冻干工艺对菌体组分的损伤较小，产品的存储时间较长，并且具有很高的活性，在工业应用中，接种量较小，活菌数
9、较高，是现如今运用最为普遍的手段13。真空冷冻干燥技术的实现包括三个步骤：第一步是预冻结，将细菌提前冻结为固态。第二步是一次脱水，细菌体内的水分将得到净化。第三步是二次烘干，提高温度可以除去一次烘干时无法除去的水分，进而减少细菌的湿度。在最后两期，细菌处于一种脱水状态，导致细菌的胞内及胞外电解质发生聚集，这就是所谓的“溶质作用”。2.2冻干条件在制作乳酸菌冻干发酵剂的过程选用适宜的时间温度能有效降低对菌体的损伤，保证其成活率。陈贺佳等14在预冻温度为-80，在 12 h 的预冷冻和 8 h 的冷冻干燥中，选定混合乳酸菌冻干保护剂配方：甘氨酸 1.0%、脱脂乳 10.0%、海藻糖7.0%、山梨醇
10、 1.0%，掺杂乳酸菌的冻干菌种存活率为 89.1%。何江波等15添加保护剂配方为脱脂乳12%、海藻糖 1%、谷氨酸钠 1%、甘油 3%，在-80下的保存效果最好，存活率最高。王艳萍等16用响应面法对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的增菌培养基进行了优化，离心收集到的菌体在-70 的冰箱先预冻 3 h，然后在冷阱温度-51、真空度 9 Pa 冷冻24 h，最终可以得到含活菌数为 1.431010CFU/g 的乳酸发酵剂，活力较高。2.3冻干保护剂在冻干进行过程中，乳酸菌的菌体受到损伤，在存储冻干菌粉的过程中，保护剂可以提升其稳定性。乳酸菌等益生菌的活菌数十分关键，选取科学的保护剂对冻干发酵剂活菌数量
11、的提升意义重大13。李玲等17借助响应面法调整真空冷冻干燥等保护剂配方，选取最优复合保护剂：葡萄糖 7.56%、脱脂乳 9.51%、麦芽糊精 7.77%，据估测，冻干后的存活率为 90.08%。陈贺佳等14通过调研指出混合乳酸菌的最优保护剂配方如下：海藻糖 7.0%、脱脂乳10.0%、山梨醇 1.0%、甘氨酸 1.0%。结合编制的配方制作冻干保护剂，并有效运用，在其中掺杂不同成分、不同浓度的保护剂确保协调，和冻干需求相符，能够实现最优保护成效。黄若辰等：乳酸菌富集培养与冻干技术研究进展5-第 1 期第 53 卷工业微生物3展望现如今，随着时代的发展，微生物学获得了快速发展，乳酸菌也得到了开发研
12、究，人们越来越重视其对人体各个方面的保健功效。目前关于如何更好地保存乳酸菌的方法国内已经有很多文献，但国内相关产业的发展仍处于起步阶段，还有许多尚未完全开发和应用的乳酸菌，随着现代生物技术的快速发展，通过对乳酸菌生产过程的不断改进，未来必将对国内乳酸菌生产技术的发展起到促进作用。参考文献1 热孜弯姑 雪合热提(Riziwangvl Xohret).饲用混合菌的富集培养及冻干工艺研究 D.新疆:新疆大学,2015.2 CoulibalyI,Dubois-Dauphin R,DanthineS,etal.PreservationofindustrialsLacticacidbacteria(pro
13、biotics)byfreeze-drying J .Biotechnologie,Agronomie,Socit et Environnement,2011,15(2):287-299.3 LIUXT,HOUCL,ZHYANGJ,etal.Fermentationconditionsinfluence the fatty acid composition of the membranes ofLactobacillus reuteri I5007 and its survival followingfreeze-dryingJ.Letters in Applied Microbiology,
14、2014,59(4):398-403.4 陈雪,王伟,杨丽杰.乳酸乳球菌直投式发酵剂乳清增菌发酵培养基的优化 J.食品科技,2013,38(4):11-16.5 田文,邵秀芝,姜秀敏,等.直投式泡菜乳酸菌发酵剂培养基的优化及离心条件的探索 J.食品工业,2012,33(2):99-101.6 BURY D,JELEN P,KIMURA K.Whey protein concentrateas a nutrient supplement for lactic acid bacteria J.InternationalDairy Journal,1998,8(2):149-151.7 姜铁民,隋欣
15、,王建,等.直投式发酵剂制备中乳酸菌增殖条件的探讨 J.食品与发酵工业,2005(8):112-114.8 BAI D,YAN Z,WEI Q,etal.AmmoniumlactateproductionbyLactobacilluslactisBME5-18MinpH-controlledfed-batch fermentationsJ.Biochemical EngineeringJournal,2003,19(1):47-51.9 万红兵,田洪涛,马乐辉,等.保加利亚乳杆菌番茄复合汁增菌培养基的优选研究 J.中国乳品工业,2006(8):14-17.10 李志成,张连斌,王碧德,等.发酵
16、温度对冻干乳酸菌发酵剂活菌数的影响 J.西北农业学报,2006(2):156-158.11 王建,隋欣,姜铁民,等.直投式酸奶发酵剂菌体浓缩的研究 J.食品工业科技,2007(11):73-75.12 张建友,赵培城,徐静波,等.直投式酸奶发酵剂中高浓度细胞悬浮液的制备研究 J.现代食品科技,2005(01):9-12,16.13 任亚妮.四川泡菜专用乳酸菌发酵剂的研究 D.成都:西华大学,2011.14 陈贺佳,牟光庆.混合乳酸菌复合冻干保护剂的研究J.食品研究与开发,2013,34(18):133-136.15 何江波.羊瘤胃源乳酸菌的分离筛选及其菌剂制备方法研究 D.西北农林科技大学,2021.16 王艳萍,许女,赵江,等.乳酸菌直投发酵剂培养与冷干条件的优化 J.食品科技,2007(02):41-45.17 李玲,赵耀,曹珂珂.乳酸菌冻干工艺的设计 J.安徽农学通报,2017,25(14):43-45.AbstractLactic acid bacteria are probiotics,which are beneficial to human health.However,