1、中国中医急症 2023年1月第32卷第1期JETCM.Jan.2023，Vol.32，No.1 研究报告 动脉粥样硬化是导致急性心脑血管危重症的重要因素，严重威胁人类生命健康1。血管平滑肌细胞（VSMC）是血管中膜的主要细胞成分，在动脉粥样硬化的形成中起重要作用2。当血管内皮细胞受到损伤时，血管释放炎性细胞因子和生长因子，诱导VSMC迁移、增殖和分化，导致内膜增厚、斑块形成和管腔狭窄2-4。三七是临床常用的传统中药，具有活血化瘀、消肿镇痛、强壮补虚等功效。三七皂苷R1（Notoginsenoside R1）是三七提取物中有效活性成分之一，具有减轻炎症、修复内皮细胞障碍等作用，可减轻动脉粥样硬化
2、的进展5-7，然而，三七皂苷R1对VSMC迁移的影响尚不清楚。本研究观察了三七皂苷R1对VSMC迁移的影响并初步探讨了其可能的分子机制。1材料与方法1.1细胞人源VSMC（货号：MZ-1186）购自宁波明舟生物科技有限公司。用DMEM完全培养基在37、5%CO2环境下培养，DMEM完全培养基含有10%FBS、1%双抗生素（青霉素/链霉素）、10 mmol/L HEPES 和10 mmol/L TES。三七皂苷 R1 对血管平滑肌细胞迁移及 p38MAPK蛋白的影响蔡婷1，2潘力弢2李蒋凤1谭亮1张梦1李晶晶1樊光辉1，3（1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430061；2.广东省深圳市第二人民医
3、院，广东 深圳 518055；3.深圳大学附属华南医院，广东 深圳 518111）中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1004-745X（2023）01-0055-04doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2023.01.012【摘要】目的 观察三七皂苷R1对血管平滑肌细胞（VSMC）迁移及p38 MAPK蛋白的影响。方法 用Ang诱导VSMC迁移建立细胞迁移模型，将迁移的VSMC随机分为对照组和三七皂苷R1低、中、高剂量组（5、10、20 mol/L）。用细胞划痕实验检测VSMC迁移面积，Western blotting法检测MMP2、MMP9、磷酸化p38
4、MAPK及p38 MAPK蛋白表达。结果 与对照组相比，三七皂苷R1中、高剂量组均能明显减少VSMC的细胞迁移面积及MMP2、MMP9迁移蛋白表达（P0.05），且呈剂量依赖性；与对照组相比，三七皂苷R1中、高剂量组均能明显减少p38 MAPK蛋白磷酸化（P0.05），且呈剂量依赖性。结论 三七皂苷R1抑制了Ang诱导的VSMC迁移面积，同时下调MMP2和MMP9迁移蛋白，且呈剂量依赖性，其机制可能与降低p38 MAPK蛋白磷酸化有关。【关键词】血管平滑肌细胞迁移三七皂苷R1p38 MAPKMMP2MMP9Effects of Notoginsenoside R1 on Vascular Sm
5、ooth Muscle Cell Migration and p38 MAPK ProteinCai Ting，Pan Litao，Li Jiangfeng，Tan Liang，Zhang Meng，Li Jingjing，Fan Guanghui.Hubei University ofChinese Medicine，Hubei，Wuhan 430061，China.【Abstract】Objective：To investigate the effects of notoginsenoside R1（NGR1）on vascular smooth muscle cells（VSMCs）mi
6、gration and p38 MAPK protein.Methods：VSMCs were induced by Ang to establish cells migration model.The migration VSMCs were randomly divided into the control group，NGR1 low-dose group（5 mo/L），medium-dose group（10 mo/L），and high-dose group（20 mo/L）.The area of VSMCs migration were detectedby cells scr
7、atch assay，and the MMP2，MMP9，phosphorylated p38 MAPK and p38 MAPK proteins were detectedby Western blotting.Results：Compared with the control group，both NGR1 medium and high dose groups couldsignificantly reduce the cell migration area and the MMP2 and MMP9 migration proteins（P0.05），and the inhibito
8、ry effect were dose dependent.The phosphorylation of p38 MAPK protein was also significantly reduced（P 0.05）and dose dependent.Conclusion：NGR1 can inhibit Ang-induced VSMC migration and reduce theMMP2 and MMP9 proteins to express in a dose-dependent manner，and the mechanism may be related to decreas
9、e the phosphorylation of p38 MAPK protein.【Key words】VSMC；Migration；Notoginsenoside R1；P38 MAPK；MMP2；MMP9基金项目：深圳市高等院校稳定支持计划（20200831114632002）通信作者（电子邮箱：）-55中国中医急症 2023年1月第32卷第1期JETCM.Jan.2023，Vol.32，No.1组 别对照组三七皂苷R1低剂量组三七皂苷R1中剂量组三七皂苷R1高剂量组MMP2126.563.74107.933.0761.602.15*53.672.04*MMP9117.173.46106
10、.373.0350.701.77*33.311.27*p38 MAPK132.184.17134.922.12136.362.83134.991.09P-p38 MAPK95.723.1877.682.2151.182.62*47.602.48*表2各组MMP2、MMP9、p38 MAPK和P-p38 MAPK蛋白表达比较（%，xs）注：MMP2、MMP9和p38 MAPK数值均是其条带灰度值相对内参GAPDH条带灰度值的百分比值；P-p38 MAPK数值是其相对p38 MAPK条带灰度值的百分比值。1.2试药与仪器三七皂苷R1（上海源叶生物技术有限公司，货号：B21099），纯度98%。An
11、g（MedChem Express公司，货号：HY-13948）。DMEM培养基（货号：11965118）和胎牛血清（货号：10100147）购自Thermo Fisher Scientific 公司。兔抗鼠 MMP2（货号：ab92536）、MMP9（货号：ab76003）、phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）（货号：ab4822）和 GAPDH（货号：ab181602）均购自Abcam公司，兔抗鼠p38 MAPK（碧云天生物技术有限公司，货号：AF7668）。鼠抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG抗体（Santa Cruz公司，货号：sc-2357）。倒置显微镜（Oly
12、mpus公司，型号：BX43）。1.3分组与干预取对数生长期细胞，制备细胞悬液，调节细胞密度为1105/mL，均匀接种于6孔板中。参照课题组前期实验及相关文献选用1 mol/L的Ang诱导VSMC迁移，建立细胞迁移模型8-10。将发生迁移的VSMC随机分组，用不同浓度（5、10、20 mol/L）的三七皂苷R1干预48 h，分别记为三七皂苷R1低、中、高剂量组，未用药物处理的则为对照组。1.4细胞划痕实验当细胞处于峰-谷生长状态时，用10 L的无菌枪头在每个6孔板中划上35条平行横线。无菌PBS清洗以除去不黏附的细胞，随后按照各实验组的要求处理细胞并培养48 h。用4%多聚甲醛固定细胞15 m
13、in，按照结晶紫染色步骤进行染色，用倒置显微镜观察细胞伤口愈合情况。用Image J软件计算各实验组的相对迁移面积。1.5蛋白质印迹实验按照各实验组的要求处理细胞并培养48 h。用含有蛋白酶的RIPA裂解缓冲液在冰上裂解VSMC细胞收集总蛋白质。总蛋白质经BCA定量后，每孔上样20 g，用10%SDS-PAGE凝胶分离蛋白，转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉溶液在25 下孵育膜1 h。然后用TBST洗涤膜，并与相应的抗体（1 1 000稀释）在4 摇床孵育过夜，TBST洗涤，然后与HRP结合的二抗溶液（1 5 000稀释液）在25 孵育1 h，TBST洗涤，曝光、显影，用ImageJ软件对蛋白
14、质条带进行定量分析。1.6统计学处理应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（xs）表示。组间差异比较采用单因素方差分析，然后采用LSD法进行检验。P 0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组VSMC迁移面积的比较见表1。三七皂苷R1对Ang诱导的VSMC迁移有抑制作用，且呈剂量依赖性，与对照组相比有显著差异，见图1。进一步用Image J软件分析各组细胞迁移面积，与对照组相比，三七皂苷R1低、中、高剂量组能显著减少VSMC迁移面积，差异有统计学意义（P 0.05或P 0.01）。与低剂量组相比，中剂量组减少VSMC迁移面积不明显，但高剂量组能显著减少VSMC迁移面积，差异有统计学意义（P
15、0.05）。2.2各组MMP2、MMP9、p38 MAPK和P-p38 MAPK蛋白表达的比较见表2。三七皂苷R1使MMP2、MMP9和P-p38 MAPK蛋白表达减少，且与三七皂苷R1剂量呈负相关，p38 MAPK 蛋白在各组中没有变化，见图2。用Image J分析蛋白条带灰度值，与对照组相比，三七皂苷R1中剂量组和三七皂苷R1高剂量组的MMP2和MMP9蛋白条带相对灰度值明显减少，有显著差异（P 0.05），但P-p38 MAPK蛋白条带相对灰度值随着三七皂苷R1剂量增加而减少，中、高剂量组差异有统计学意义（P0.05或P0.01）。与低剂量组比较，中、高剂量组的MMP2和MMP9蛋白条带
16、相对灰度值明显减少，差异有统计学意义（P0.05或P0.01）；p38 MAPK蛋白条带相对灰度值各组均无变化；中剂量组的P-p38 MAPK蛋白条带相对灰度值减少，但差异不明显；高剂量组的P-p38 MAPK蛋白条带相对灰度值显著减少，差异有统计学意义（P0.05）。对照组三七皂苷R1低剂量组 三七皂苷R1中剂量组 三七皂苷R1高剂量组图1各组VSMC迁移情况（结晶紫染色，40倍）表1各组VSMC相对迁移面积比较（xs）注：与对照组比较，P0.05，P0.01；与三七皂苷R1 低剂量组比较，P0.05，P0.01。下同。组 别对照组三七皂苷R1低剂量组三七皂苷R1中剂量组三七皂苷R1高剂量组相对迁移面积（%）100.003.9280.354.36*67.605.23*46.836.66*-56中国中医急症 2023年1月第32卷第1期JETCM.Jan.2023，Vol.32，No.13讨论动脉粥样硬化是急性心脑血管疾病的病理基础，也是急性心脑血管事件发生的重要危险因素。动脉粥样硬化是现代医学名，中医学中并无其记载，但根据其致病特点和临床表现，可将其归属于“瘀证”“痰证”“脉痹”等范