1、第 14 卷 第 2 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.2 2023 年 1 月 Journal of Food Safety and Quality Jan.,2023 基金项目:国家自然科学基金项目(32072338)Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(32072338)*通信作者:李振兴,教授,主要研究方向为食品安全与质量检测。E-mail:*Corresponding author:LI Zhen-Xing,Professor,Ocean University
2、 of China,No.1299,Sansha Road,Huangdao District,Qingdao 266400,China.E-mail: 扇贝过敏原荧光免疫层析检测方法的构建与应用 党雪文1,张自业1,赵金龙1,李冉冉1,王雅晴2,林 洪1,王 皓1,李振兴1*(1.中国海洋大学食品科学与工程学院,青岛 266400;2.青岛海洋食品营养与健康创新研究院,青岛 266109)摘摘 要要:目的目的 构建一种简便、快速、可降低非特异性荧光干扰的时间分辨免疫层析检测方法,实现快速检测扇贝中原肌球蛋白(tropomyosin,TM)过敏原。方法方法 本研究采用双抗体夹心免疫层析法,以含
3、有铕(Eu)纳米微粒的荧光微球作为标签偶联兔抗 TM 多克隆抗体,制备荧光探针并对其进行表征。以 4 mg/mL 兔多克隆抗体作为 T 线,羊抗兔免疫球蛋白 G(immunoglobulin g,IgG)作为 C 线组装免疫层析试纸条。结果结果 本研究组建的试纸条视觉检出限为 0.05 g/mL,仪器检出限为 0.01 g/mL。试纸条除对虾蟹有交叉反应外,对其他 10 余种物种无明显交叉反应。加标样品批内和批间变异系数分别为 3.71%7.94%和 12.09%12.80%,在不含 TM的 4 种食物基质中加入浓度由低到高的 TM,检测结果与实际加标情况相符。结论结论 本检测方法准确性良好、
4、灵敏度高、特异性强,可在多种食物基质中实现对扇贝 TM 的快速检测。关键词关键词:时间分辨荧光微球;免疫层析;扇贝过敏原;原肌球蛋白;快速检测 Construction and application of a fluorescence immunochromatographic assay for allergen detection of scallops DANG Xue-Wen1,ZHANG Zi-Ye1,ZHAO Jin-Long1,LI Ran-Ran1,WANG Ya-Qing2,LIN Hong1,WANG-Hao1,LI Zhen-Xing1*(1.College of Fo
5、od Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266400,China;2.Qingdao Marine Food Nutrition and Health Innovation Research Institute,Qingdao 266109,China)ABSTRACT:Objective To establish a simple,rapid and time-resolved immunochromatography assay which can reduce non-specific fluorescen
6、ce interference,and realize the rapid detection of tropomyosin(TM)allergens in scallops.Methods In this study,double antibody sandwich immunochromatography was used to couple rabbit anti-TM polyclonal antibody with fluorescent microspheres containing europium(Eu)nanoparticles as a label,and the fluo
7、rescent probes were prepared and characterized.The immunochromatographic test strip was assembled with 4 mg/mL rabbit polyclonal antibody as the T-line and goat anti-rabbit immunoglobulin g(IgG)as the C-line.Results The visual limit of detection of the test strip constructed in this study was 0.05 g
8、/mL,and the limit of detection of the instrument was 0.01 g/mL.Except for cross reaction with shrimp and crab,the test strips showed no significant cross reaction with more than other 10 species.The coefficient of variation within and between batches of the spiked samples were 3.71%7.94%and 12.09%12
9、.80%respectively.TM was added into the 4 kinds of food matrices that did not contain TM from low concentration to high concentration,and the test results were consistent with the actual spiked conditions.Conclusion This method has good accuracy,high sensitivity and strong DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956
10、/ts.2023.02.007第 2 期 党雪文,等:扇贝过敏原荧光免疫层析检测方法的构建与应用 51 specificity,and can be used for rapid detection of scallop TM in various food substrates.KEY WORDS:time-resolved fluorescent microspheres;immunochromatography;scallop allergens;tropomyosin;rapid detection 0 引 言 近年来,食物过敏发病率逐年增加,已成为影响世界人民健康的重要隐患。海产品是
11、人类优质动物蛋白质的重要来源,随海产品生产和消费的增加,海产品食物过敏的发病率日益升高。研究表明,目前全世界有高达 2.5%的人口对海产品有食物过敏反应1。与鱼类和甲壳类食物过敏相似,软体动物容易在敏感人群中引发食物过敏反应,软体动物贝类目前在欧盟、加拿大和亚洲沿海国家被认定为是一种常见的致敏性食物2。然而现如今对软体类动物过敏原的研究较少。扇贝作为软体动物贝类的一种,常作为各种加工食品的原料,如酱汁、调味粉、油炸零食等。然而微量的过敏原成分可能会引起机体产生荨麻疹、哮喘、休克等过敏反应,并持续一生。扇贝的主要过敏原是原肌球蛋白(tropomyosin,TM),分子质量为 3842 kDa,是
12、一种热稳定性蛋白,在加工过程中不易被降解1。TM 在同一类群(同一目或同一种)软体动物中同源性较高,且 TM 在软体动物之间以及软体动物与甲壳类动物之间存在交叉致敏性3。由于目前还没有有效根治食物过敏的方法,避免过敏原摄入仍是现阶段治疗食物过敏最有效的途径。欧洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)、美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)及其他组织已制定若干法律强制对致敏成分进行标识4。然而由于交叉污染、产品标签错误、清洁不当和食品掺假等问题,食品安全问题不断出现5。目前国内外已开发的针对食物过敏
13、原的检测方法,可分为基于 DNA 的检测技术(如聚合酶链式反应、环介导等温扩增技术)以及基于过敏原蛋白质的检测技术6。其中免疫学方法是过敏原快速检测的首选方法,包括酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、横向流动免疫法(lateral flow immunoassay,LFIA)等,然而ELISA 方法需要酶与底物长时间孵育,且需要专业的仪器设备,不适于现场快速检测6。相比之下 LFIA 操作简单、检测快速,目前多用于样品现场筛选。最近一些基于 LFIA的方法已用于食物过敏原检测,如高红艳等7使用 LFIA方法检测甲壳类 TM,检出限
14、可低至 0.01 g/mL;ANFOSSI等8选择金和银纳米粒子设计多色新型 LFIA 同时检测酪蛋白、卵清蛋白和榛子蛋白;XI 等9结合拉曼光谱和胶体金 LFIA 检测技术以实现大豆过敏原高效、准确检测。胶体金作为传统的标记颗粒在食品工业中有着很大应用潜力,但在实际应用中存在胶体稳定性差且颜色单一不利于高通量检测的应用。由于其局限性,现已开发了许多新型材料如量子点、磁纳米颗粒、荧光微球作为 LFIA 标记物1012。时 间 分 辨 荧 光 微 球 免 疫 分 析 技 术(time-resolved fluorescence immunochromatography assay,TRFIA)以
15、稀土元素标记抗原或抗体,利用时间域区分短寿命自发荧光和长寿命荧光标记物,能有效避免背景荧光干扰13,与传统荧光团相比,镧系元素螯合物具有较长的荧光寿命与较大的斯托克位移,衰减时间为 102000 s,是传统荧光的 103倍。羧基修饰的 Eu-时间分辨荧光微球将大量的镧系元素嵌入聚苯乙烯微球中,不仅提高了荧光标记效率和灵敏度,所形成的聚苯乙烯网格也保护镧系螯合物不受外界环境的影响13。该特性也降低了 TRFIA 受到食物基质效应影响的可能性,对于免疫分析技术,食物基质中多酚、单宁、乙醇和酸的存在均会阻碍目标过敏原蛋白质的检测,量子点和磁纳米颗粒都易受其干扰1415。目前为止时间分辨荧光微球并未广
16、泛应用于食物过敏检测领域,基于流行病学、诊断和食品标签的研究也主要关注于甲壳类动物 TM,建立的检测方法主要以甲壳类过敏原为主,对于软体动物TM 的检测方法目前无较多信息。如今也未有关于检测扇贝过敏原的试纸条的研究。因此基于以上特性本研究选用时间分辨荧光微球作为标记物,偶联兔多克隆抗体制备荧光探针,构建时间分辨荧光微球免疫层析方法,并对其灵敏度、特异性、精密度进行评价,评估其对扇贝主要过敏原 TM 的检测性。为实现扇贝过敏原快速检测,为食品企业快速筛查过敏原提供新途径。1 材料与方法 1.1 材料与试剂 栉孔扇贝(Azumapecten farreri)、蟹(Scylla paramamosain)、基围虾(Metapenaeus ensis)、鲈鱼(Lateolabrax japonicus)、羊肉、猪肉、鸡肉、大豆(Glycine max)、鸡蛋、花生、大米、核桃、腰果(青岛家乐福超市);挂面、豆粉、芝麻糊、燕麦(青岛利群超市)。300 nm 羧基化铕荧光微球(Eu-FM)(苏州为度生物技术公司);N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(N-hydroxysulfosuccinimide so